COMT與蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦血管痙攣的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期大鼠COMT表達(dá)的變化及意義。 目的：觀察實(shí)驗(yàn)性SAH后早期大鼠COMT的mRNA和蛋白表達(dá)、血漿CA含量、基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度的變化規(guī)律，探討SAH后早期大鼠COMT表達(dá)變化的意義。 方法：以視交叉前池單次注血法構(gòu)建大鼠SAH模型。采用RT-PCR法、Western Blotting法檢測(cè)大鼠SAH后早期各個(gè)時(shí)相點(diǎn)（SAH后6h、12h、24h、48h、72h）紋狀體組織內(nèi)COMT的

2、mRNA和蛋白表達(dá)。采用高效液相色譜法測(cè)定大鼠相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)血漿CA含量。HE染色后測(cè)量大鼠相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度。 結(jié)果：假手術(shù)組大鼠COMT的mRNA和蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，SAH組大鼠在建模后6h見COMT的mRNA和蛋白表達(dá)開始增高（P<0.01），12h時(shí)達(dá)到高峰（P<0.01），24h后開始下降（P<0.01），48h時(shí)仍高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)

3、相點(diǎn)水平（P<0.01）。至建模后72h時(shí)接近正常水平，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 假手術(shù)組大鼠血漿CA含量與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。SAH組大鼠在建模后6h即見血漿CA含量升高，24h時(shí)達(dá)到峰值，24h后開始下降，至72h后仍高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)水平。各時(shí)相點(diǎn)CA含量與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。 假手術(shù)

4、組大鼠基底動(dòng)脈的管徑和管壁厚度與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，SAH組大鼠在建模后6h基底動(dòng)脈的管徑開始縮小，管壁開始增厚，但變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；建模后12h，基底動(dòng)脈的管徑縮小和管壁增厚進(jìn)一步加重（P<0.01），至建模后24h最明顯（P<0.01）并持續(xù)至建模后48h（P<0.01）；建模后72h，基底動(dòng)脈的管徑和管壁厚度已接近正常大?。≒>0.05）。 結(jié)論：（1）實(shí)

5、驗(yàn)性SAH可以誘導(dǎo)SAH后早期大鼠紋狀體COMT表達(dá)增高。（2）實(shí)驗(yàn)性SAH后早期CA含量明顯升高并伴有CVS發(fā)生。（3）SAH后早期CVS和血漿CA含量增高可能與SAH后早期COMT表達(dá)增高不夠充分和持久有關(guān)。 第二部分 pAdxsi-GFP-rCOMT重組腺病毒載體的構(gòu)建、包裝、擴(kuò)增、純化。 目的：構(gòu)建Ad-GFP-rCOMT重組腺病毒載體體系，為研究COMT基因轉(zhuǎn)染提供材料。 方法：擴(kuò)增得到目的基因片段克隆

6、到pGEM-T Easy Vector上，得到rCOMT-T克隆載體。從rCOMT-T克隆載體上EcoRI酶切得到rCOMT基因，連接到pShuttle-GFP-CMV載體，得到pShuttle-GFP-rCOMT。將pShuttle-GFP-rCOMT轉(zhuǎn)移至pAdxsi載體上，得到Ad-GFP-rCOMT病毒質(zhì)粒。Ad-GFP-rCOMT質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切、酚氯仿抽提、乙醇沉淀后，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞。將重組腺病毒大量擴(kuò)增，然

7、后用CsCl密度梯度超離心法進(jìn)行純化，加入10％滅菌甘油，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果：酶切和PCR鑒定證明rCOMT-T克隆載體質(zhì)粒、重組穿梭載體質(zhì)粒和重組腺病毒載體質(zhì)粒完全正確，并能在293-T細(xì)胞中融合表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建Ad-GFP-rCOMT重組腺病毒載體體系，并成功轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，為研究COMT基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。 第三部分 pAdxsi-GFP-rCOMT重組腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)SAH大鼠COMT表

8、達(dá)的影響。 目的：探討基因轉(zhuǎn)染對(duì)實(shí)驗(yàn)性SAH后早期大鼠COMT表達(dá)、血漿CA含量及基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度的影響。 方法：以視交叉前池單次注血法構(gòu)建大鼠SAH模型。建模后即刻采用立體定向技術(shù)在SAH模型大鼠的紋狀體內(nèi)注射pAdxsi-GFP-rCOMT重組腺病毒。采用RT-PCR法、Western Blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)（轉(zhuǎn)染后6h、12h、24h、48h、72h）紋狀體組織內(nèi)COMT的mRNA和蛋白表達(dá)。

9、采用高效液相色譜法測(cè)定大鼠相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)血漿CA含量。HE染色后測(cè)量大鼠相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后6h腺病毒注射組大鼠紋狀體組織中COMT的mRNA和蛋白表達(dá)開始增高，但與SAH組、空載體注射組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。自轉(zhuǎn)染后12h開始COMT的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)更加明顯，于24h時(shí)達(dá)到峰值，24h后開始下降直至轉(zhuǎn)染后72h，各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)水平均明顯高于SAH組和空載體注射組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)水平（P<

10、0.01）。 腺病毒注射組大鼠血漿CA含量在轉(zhuǎn)染后6h開始增高，但與SAH組、空載體注射組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。自轉(zhuǎn)染后12h開始血漿CA含量升高更加明顯，并于轉(zhuǎn)染后24h達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)染后24h開始下降，至48h時(shí)下降更加明顯，至72h時(shí)已降至接近正常水平，各時(shí)相點(diǎn)CA含量與SAH組和空載體注射組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)水平比較均有明顯降低（P<0.01）。 腺病毒注射組大鼠在轉(zhuǎn)染后6h基底動(dòng)脈的管徑開始縮小，管壁開始

11、增厚，但與SAH組和空載體注射組比較變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。轉(zhuǎn)染后12h，基底動(dòng)脈的管徑縮小和管壁增厚進(jìn)一步加重，至轉(zhuǎn)染后24h最明顯并持續(xù)至48h，但各時(shí)相點(diǎn)與SAH組和空載體注射組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較均有明顯改善（P<0.01）。轉(zhuǎn)染后72h，基底動(dòng)脈的管徑縮小和管壁增厚明顯緩解接近正常大?。≒>0.05）。 結(jié)論：（1）pAdxsi-GFP-rCOMT重組腺病毒可明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)染后早期（轉(zhuǎn)染12h后）各個(gè)時(shí)相點(diǎn)COMT表達(dá)

12、水平，且高表達(dá)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。（2）與SAH組和空載體注射組比較，轉(zhuǎn)染12h后各時(shí)相點(diǎn)血漿CA含量明顯下降，CVS明顯緩解。（3）轉(zhuǎn)染后血漿CA含量下降及CVS緩解可能與重組腺病毒所誘導(dǎo)的COMT表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)有關(guān)。（4）再次證實(shí)了實(shí)驗(yàn)性SAH后早期CVS和血漿CA含量增高與SAH后早期COMT表達(dá)增高不夠充分和持久的相關(guān)性。 第四部分 COMT基因多態(tài)性與SAH后早期CVS的相關(guān)性分析。 目的：探討COMT基因多態(tài)性與S

13、AH后早期CVS的相關(guān)性。 方法：搜集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一院神經(jīng)外科2008年1月至2008年12月收治的自發(fā)性SAH急性期（<3d）患者167例，采集靜脈血，記錄臨床資料。運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)分析SAH患者COMT基因型及等位基因頻率。運(yùn)用TCD判定SAH患者早期CVS的嚴(yán)重程度。運(yùn)用Hunt-Hess分級(jí)評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度。運(yùn)用頭顱CT的Fisher分級(jí)評(píng)估出血量的多少。采用X2檢

14、驗(yàn)和Logistic回歸分析等方法（SPSS13.0軟件）分析COMT基因分型結(jié)果等臨床資料與CVS的相關(guān)性。 結(jié)果：各等位基因分布符合Hardy-Weinberg定律，研究樣本為遺傳平衡群體。A等位基因攜帶者的CVS發(fā)生率（51.7％）明顯高于G等位基因攜帶者（38.5％）。A/A基因型患者CVS發(fā)生率（66.7％）明顯高于G/G（35.9％）。單因素Logistic回歸分析提示A等位基因、A/A基因型和Hunt&Hess分級(jí)