前列腺特異膜抗原新剪接變異體PSM-F的發(fā)現(xiàn)與真核表達載體構(gòu)建.pdf

1、研究背景與目的 前列腺特異膜抗原(PSMA)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達于前列腺上皮細胞，具有較高的前列腺特異性和膜結(jié)合特性，是近年前列腺癌研究的熱點之一。PSMA在正常前列腺中低表達，在大多數(shù)前列腺癌組織中高表達，并隨腫瘤的進展而表達增高，在轉(zhuǎn)移癌及激素不敏感型前列腺癌中表達進一步增高，提示PSMA可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是目前公認的前列腺癌診斷及治療靶標之一。 PSMA存在多種剪接變異現(xiàn)象，目前發(fā)現(xiàn)并報道的PSM

2、A剪接變異體己有四個。諸多研究提示，PSMA的選擇剪接與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。深入該領(lǐng)域的研究有利于揭示前列腺癌的發(fā)牛機制，對尋求更加特異有效的前列腺癌診治靶標具有重要意義。 既往有關(guān)PSMA剪接變異的研究多聚焦于對某單一變異體的表達鑒定及臨床意義的闡述。由于缺乏系統(tǒng)有效的研究方法和手段，對其剪接機制多樣性的認識存在一定的片面性。為了從整體上了解PSMA的剪接變異現(xiàn)象，本研究擬建立以RACE技術(shù)為基礎的有關(guān)PSMA剪接變異

3、體多樣性的分析方法，旨在最大程度地發(fā)現(xiàn)可能存在的PSMA剪接變異體，并對新發(fā)現(xiàn)變異體進行鑒定證實。在此基礎上構(gòu)建其真核表達載體，為后續(xù)的相關(guān)研究墊定實驗基礎。 材料與方法 1.在PSMA各變異體的相對公共區(qū)序列設計錨定引物，應用RACE技術(shù)在LNcap細胞中進行擴增。 2.RACE產(chǎn)物經(jīng)測序后，應用計算機軟件進行測定序列的拼接、比對分析。選取拼接序列的來源RACE片段作為模板，采用重疊PCR進行完整序列的重構(gòu)。

4、 3.設計重構(gòu)序列的特異性引物，在LNcap細胞中進行PCR擴增，驗證其天然表達。 4.應用ORFfinder程序查找此序列的開放讀碼框架，設計引物PCR擴增完整ORF序列，并克隆入真核表達載體pcDNA3.0。 結(jié)果與討論 應用RACE技術(shù)在LNcap細胞進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)計算機軟件拼接分析及重疊PCR重構(gòu)，我們得到一條不同于以往PSMA各變異體序列的完整新序列。經(jīng)證實該序列在LNcap細胞天然表達，確認為

5、一種新的PSMA變異體(Genebank號：EF488812)。盡管該新變異體的臨床及生物學意義尚有待進一步研究證實，但它的發(fā)現(xiàn)無疑證實和豐富了PSMA剪接變異的多樣性，為深入研究前列腺癌的發(fā)生機制，尋求有效的診斷標志和治療靶點拓展了思路，提供了新的線索。 在上述研究的基礎上，我們構(gòu)建了PSM-F的真核表達載體pcDNA3.0／PSM-F。新構(gòu)建的重組子經(jīng)測序鑒定證實，目的基因與模板序列100％同源，且插入方向及讀碼框架準確無誤

6、，表明PSM-F真核表達載體構(gòu)建成功。此為PSM-F在真核細胞中的表達及后續(xù)相關(guān)研究打下了基礎。 然而，有關(guān)PSMA變異體研究的一個重要方向及內(nèi)容就是闡明它的臨床及生物學意義，以確定其臨床及研究中的理論價值與應用前景。而這些又有賴于對其在不同組織來源細胞及不同病理改變前列腺組織中表達差異和生物學功能的了解，以及對不同PSMA變異體之間相互作用及關(guān)系的認識。有關(guān)工作本實驗組正加緊研究，相關(guān)結(jié)果將另文報道。關(guān)于PSMA的選擇性剪接機