前列腺特異膜抗原新剪接變異體PSM-F真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、[研究背景]： 前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高居男性癌性死亡的第二位。發(fā)病隱匿和易轉(zhuǎn)移是臨床診斷和治療前列腺癌的最大障礙。目前前列腺癌的病因尚不明確，可能與遺傳、環(huán)境和性激素等多因素有關(guān)。前列腺癌特異膜標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)生物診斷和生物治療的基礎(chǔ)，探索前列腺癌特異膜標(biāo)志物在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制十分重要。 前列腺特異膜抗原(prostate—specific membrane antigen，PSMA)主要表

2、達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞膜表面，具有較高的前列腺癌特異性和膜結(jié)合特性，是近年來(lái)前列腺癌研究熱點(diǎn)之一。PSMA是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有葉酸水解酶活性和NAALADase酶活性。PSMA在正常前列腺中低表達(dá)，在大多數(shù)前列腺癌組織中高表達(dá)，并隨腫瘤進(jìn)展而表達(dá)增高，在轉(zhuǎn)移癌及激素不敏感型前列腺癌中表達(dá)進(jìn)一步增高，提示PSMA可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但PSMA在前列腺癌中的具體作用及機(jī)制尚不明了。相關(guān)研究提示PSMA可能與前列腺癌的生長(zhǎng)侵襲有關(guān)。

3、 選擇剪接是轉(zhuǎn)錄后修飾的一個(gè)普遍現(xiàn)象，是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣化的重要機(jī)制之一，與人類多種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PSMA也存在多種選擇剪接形式，而且許多研究提示，PSMA的選擇剪接與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。深入該領(lǐng)域的研究有利于揭示前列腺癌的發(fā)生機(jī)制，對(duì)尋求更加特異有效的前列腺癌診治靶標(biāo)具有重要意義。 PSM—F是本課題組近期發(fā)現(xiàn)的PSMA新型剪接變異體，經(jīng)證實(shí)該序列在LNcap細(xì)胞天然表達(dá)，確認(rèn)為一種新的PSMA

4、變異體(Genebank號(hào)：EF488812)。它的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑證實(shí)和豐富了PSMA剪接變異的多樣性。為了進(jìn)一步研究這種新的剪接變異體PSM—F，本研究擬排除PSM—F前段非編碼區(qū)(UTR)的干擾，僅克隆其完整的開(kāi)放讀碼框架，重新構(gòu)建PSM—F的真核表達(dá)載體，記為pcDNA3.0/PSM—F’，并在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，為后續(xù)的相關(guān)研究墊定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [目的]： 1.構(gòu)建PSMA新型剪接變異體PSM—F完整開(kāi)放讀碼框架的真核表

5、達(dá)載體pcDNA3.0/PSM—F’。 2.在真核細(xì)胞中表達(dá)PSM—F，PSM—F的成功表達(dá)將為進(jìn)一步深入研究PSM—F打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 [方法]： 1.本研究在前期工作基礎(chǔ)上，以本實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.0/PSM—F質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增只包含PSM—F的完整開(kāi)放讀碼框架的目的基因片段，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0/PSM—F’，經(jīng)PCR、雙酶切和堿基測(cè)序鑒定。 2.將鑒定陽(yáng)性的pcDNA3.0

6、/PSM—F’使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞CHO，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RT—PCR、間接免疫熒光和免疫印跡分別從基因水平和蛋白水平鑒定G418抗性細(xì)胞中有無(wú)目的蛋白表達(dá)。 [結(jié)果]： 1.測(cè)序結(jié)果表明目的片段在pcDNA3.0質(zhì)粒中插入方向正確，序列與模板100％同源，說(shuō)明pcDNA3.0/PSM—F’真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2.篩選出的G418抗性細(xì)胞克隆擴(kuò)增后，R

7、T—PCR鑒定結(jié)果：針對(duì)PSM—F設(shè)計(jì)的引物可從PSM—F/CHO細(xì)胞來(lái)源的cDNA和質(zhì)粒pcDNA3.0/PSM—F’中擴(kuò)出目的片段，而空質(zhì)粒pcDNA3.0以及pcDNA3.0/CHO細(xì)胞來(lái)源的cDNA為模板只能擴(kuò)出內(nèi)參，無(wú)其他條帶擴(kuò)出，說(shuō)明PSM—F在基因水平上有轉(zhuǎn)錄。免疫熒光結(jié)果及免疫印跡結(jié)果表明：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中有目的蛋白的表達(dá)，并且具有完全抗原性，裂解PSM—F/CHO細(xì)胞提取的蛋白和PSMA單抗結(jié)合可顯示較弱條帶