黑龍江肇東自然人群乙肝病毒分子流行病學(xué)初步分析.pdf

1、目的：了解黑龍江省肇東市自然人群中乙型肝炎病毒(HBV)基因型、血清亞型分布情況及基因型與血清亞型的關(guān)系；了解自然人群中HBV S基因的核苷酸水平變異及氨基酸水平變異情況；分析HBV基因型與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系。 方法：2005年，以黑龍江省肇東市雙勝村和先鋒村兩個農(nóng)村為研究現(xiàn)場，以全屯居民為研究對象，對全屯居民進(jìn)行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查，采用固相放射免疫(SPRIA)法檢測HBsAg、抗-HBs和抗-HBc三項(xiàng)乙肝病毒感染

2、指標(biāo)，采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測HBeAg和抗-HBe兩項(xiàng)感染指標(biāo)。結(jié)合1986年這兩個現(xiàn)場的血清流行病學(xué)調(diào)查資料，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月10日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇可作出明確臨床診斷的110例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者(ASC)86例，慢性乙型肝炎(CH)12例，肝硬化(LC)5例，肝細(xì)胞肝癌(HCC)1例，恢復(fù)6例。男性60例，女性50例。平均年齡36歲。對從1

3、10例研究對象中抽取的血清標(biāo)本采用巢式PCR法擴(kuò)增HBV DNA。利用QIAamp DNA BloodMini Kit，按照試劑盒操作說明書要求從200 μl血清中提取HBV DNA，將其作為模板，設(shè)計(jì)合成2對引物擴(kuò)增HBV S基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，應(yīng)用Wizard SVGel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行純化回收。將回收后的產(chǎn)物送生物公司利用ABI 3773自動熒光測序儀測序。利用DNA

4、STAR軟件對測序標(biāo)本的核苷酸序列與從GenBank中獲取的HBv A-H各基因型標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，繪制基因進(jìn)化樹，確定基因型。由核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，確定血清亞型。應(yīng)用SAS8.1軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Fisher確切概率法的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：110例血清標(biāo)本中，97例HBV DNA陽性，陽性率為88.2％。97例標(biāo)本的基因型分布為：B基因型9例，占9.3％；C型87例，占89.7％；D

5、型1例，占1.0％。血清亞型分布為：adr亞型77例，占79.4.％；adw2亞型11例，占11.3％；ayr亞型8例，占8.2％：ayw2亞型1例，占1.0％。9例B基因型標(biāo)本的血清亞型均為adw2亞型；87例C基因型標(biāo)本的血清亞型為：adrq<'+> 75例 (占86.2％)，adrq<'-> 2例 (占2.3％)，adw2 2例(占2.3％)；avr 8例(占9.2％)；1例D基因型標(biāo)本的血清亞型為avw2亞型。用Fisher確切

6、概率法對不同基因型的血清亞型構(gòu)成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P值為0.0000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 9例B基因型感染者中，4例(44.4％)為ASC，5例為CH(55.6％)；87例C基因型感染者中，3例為恢復(fù)者(3.4％)，73例為ASC (83.9％)，7例為CH (8.1％)，3例為LC (3.4％)和1例為HCC (1.2％)；1例D基因型感染者為ASC (100％)。Fisher確切概率法對不同基因型的臨床轉(zhuǎn)歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P值為0.0

7、288，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 本次試驗(yàn)共獲得84例HBV S基因540nt完整序列結(jié)果。通過對這些核苷酸序列的堿基替換位點(diǎn)以及由核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列的突變位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)131個位點(diǎn)有堿基替換現(xiàn)象，其中40個位點(diǎn)為同義突變， 89個位點(diǎn)為錯義突變，2個位點(diǎn)為無義突變。主要結(jié)構(gòu)同源區(qū)(MHR，aa100-160)發(fā)現(xiàn)45個位點(diǎn)有堿基替換現(xiàn)象，其中18個位點(diǎn)為同義突變，27個位點(diǎn)為錯義突變。錯義突變中有2個位點(diǎn)產(chǎn)生了有意義的氨基酸突

8、變—Q129H (1例)和M133L(1例)，位于抗原決定簇a的第一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)。1例在aa119～120間有三個氨基酸TTE的插入。HBV S基因每100個核苷酸替換的頻數(shù)為2.19。 結(jié)論： 1 黑龍江肇東市HBV基因型分布以C基因型為主，存在少量的B型和D型。 2 黑龍江肇東市HBV血清亞型分布以adr亞型為主(adrq<'+> 和adrq<'-> 均有，但以adrq<'+>為主)，存在少量的adw2、ay

9、r和ayw2亞型。 3 HBV不同基因型的血清亞型的構(gòu)成不同。B基因型標(biāo)本的血清亞型均為adw2；C型標(biāo)本的血清亞型主要為adr，有少量的adw2和ayr；D型標(biāo)本的血清亞型為avw2。提示HBV基因型與血清亞型存在一定的相關(guān)性。 4 HBV不同基因型的臨床轉(zhuǎn)歸不同。B基因型感染者中ASC和CH均有，CH與ASC者相比稍多。C基因型感染者中以ASC為主，CH次之，其次為恢復(fù)、LC和HCC。提示B基因型感染者較易形成CH，