EGb761對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞變化的影響.pdf

1、背景和目的
　　 慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia,CCI)是一種常見的缺血性腦血管病,是多種因?yàn)橐鹉X長(zhǎng)期灌注減少所致。與神經(jīng)元相比,長(zhǎng)期低灌注更容易導(dǎo)致腦白質(zhì)損害。
　　 腦白質(zhì)主要成分是神經(jīng)纖維和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。慢性腦缺血時(shí),髓鞘形成細(xì)胞--少突膠質(zhì)細(xì)胞減少,髓鞘脫失,神經(jīng)傳導(dǎo)受到嚴(yán)重影響,導(dǎo)致學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能障礙。星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)性增生,成為屏障阻礙髓鞘再生,同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)毒性因子,損

2、傷神經(jīng)元和包括自身在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。然而,與神經(jīng)元不同的是,膠質(zhì)細(xì)胞受損后具有較強(qiáng)的修復(fù)、再生能力,所以,以白質(zhì)損害為主的病變具有較好的恢復(fù)潛力和更高的治療價(jià)值。
　　 標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract,EGb761),含24％的銀杏黃酮苷(flavonoid)和6％的萜烯內(nèi)酯(terpenoid)等多種活性物質(zhì),藥理作用廣泛。目前,有關(guān)EGb761在腦缺血時(shí)對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的研究較多,而其對(duì)神經(jīng)膠

3、質(zhì)細(xì)胞抗缺血損傷作用的研究相對(duì)較少。
　　 本研究通過(guò)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久阻斷的方法建立慢性腦缺血大鼠模型,運(yùn)用行為學(xué)測(cè)試、組織病理學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù),探討慢性腦缺血時(shí)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能、神經(jīng)髓鞘及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化,以及EGb761對(duì)其的影響,為探索慢性腦缺血時(shí)神經(jīng)保護(hù)途徑開辟新思路、提供理論證據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　 雄性SD大鼠30只,體重220±30g,鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4、中心提供。隨機(jī)分為三組:A組為假手術(shù)組,B組為單純?nèi)毖M,C組為EGb761干預(yù)組,每組10只。
　　 2模型的制作
　　 采用永久阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備慢性腦缺血模型。單純?nèi)毖M和干預(yù)組分離并剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈；假手術(shù)組僅分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈。將符合標(biāo)準(zhǔn)EGb761含量要求的達(dá)納康片研成粉末狀,用蒸餾水溶解并混勻配成濃度為5mg/ml的溶液,術(shù)后24小時(shí)按照0.5ml/100g灌胃,假手術(shù)組和單純?nèi)毖M給予等量蒸餾水灌

5、胃。各組灌胃均每日一次,持續(xù)12周。
　　 3標(biāo)本的收集與處理
　　 模型制作12周后每組應(yīng)用Y迷宮先行學(xué)習(xí)能力測(cè)試,之后經(jīng)心臟灌注,斷頭取腦,固定后制作石蠟切片,供HE染色、髓鞘染色及免疫組化染色用。
　　 4觀察指標(biāo)
　　 (1)Y迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；(2)HE染色觀察腦組織病理變化；(3)麗春紅2R-亮綠髓鞘特殊染色觀察胼胝體區(qū)髓鞘形態(tài)變化；(4)免疫組化染色檢測(cè)大鼠腦組織皮層、胼胝體及海馬

6、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體CNPase和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)情況。
　　 5統(tǒng)計(jì)方法
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1一般情況
　　 術(shù)后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲緩、不思飲食、自潔能力下降。術(shù)后1天開始,假手術(shù)組大鼠精神較前恢復(fù),反應(yīng)較

7、前靈敏,進(jìn)食較前增多。單純?nèi)毖M、EGb761干預(yù)組的一般狀況改善相對(duì)較差。EGb761治療后,干預(yù)組狀況較單純?nèi)毖M明顯改善。
　　 2學(xué)習(xí)能力
　　 各組大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī),即達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需總電擊次數(shù)如下:假手術(shù)組33.30±1.16次；單純?nèi)毖M68.30±2.06次；EGb761干預(yù)組46.90±1.45次。與假手術(shù)組相比,單純?nèi)毖M大鼠達(dá)標(biāo)所需次數(shù)明顯增多,而干預(yù)組的學(xué)習(xí)成績(jī)明顯好于單純?nèi)毖M,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義(P<0.01)。
　　 3 HE染色
　　 假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密,層次清晰,神經(jīng)元偶見變性、壞死,大部分的細(xì)胞形態(tài)正常未見明顯的病理變化；單純?nèi)毖M細(xì)胞排列稀疏,結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,可見大量變性、壞死的神經(jīng)元,胞核皺縮,有碎片出現(xiàn),細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙,空泡變性；EGb761干預(yù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)和排列及神經(jīng)元變性、壞死較單純?nèi)毖M明顯減少。
　　 4麗春紅2R-亮綠髓鞘特殊染色
　　 各組取胼胝

9、體部位進(jìn)行觀察,參考Wakita H評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,判斷髓鞘損傷的嚴(yán)重程度。A組0.052±0.025分；B組2.808±0.176分；C組1.66±0.271分。與A組相比,B組、C組的評(píng)分明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與B組相比,C組評(píng)分降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 5 CNPase免疫組化染色
　　 各組取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察,計(jì)數(shù)CNPase陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。皮層

10、:A組9.70±1.34個(gè)；B組4.80±1.03個(gè)；C組7.10±1.10個(gè)。胼胝體:A組27.80±1.93個(gè)；B組18.20±1.75個(gè)；C組23.80±1.32個(gè)。海馬:A組7.70±0.95個(gè)；B組3.90±0.88個(gè)；C組5.70±0.82個(gè)。3個(gè)部位,B組和C組CNPase陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于A組,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組CNPase陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于C組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 6 G

11、FAP免疫組化染色
　　 各組取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察,計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。皮層:A組12.90±1.66個(gè)；B組28.20±1.87個(gè)；C組19.40±1.43個(gè)。胼胝體:A組17.01±1.49個(gè)；B組28.50±1.58個(gè)；C組22.00±1.49個(gè)。海馬:A組10.50±2.55個(gè)；B組24.30±2.46個(gè)；C組16.60±1.51個(gè)。3個(gè)部位,B組和C組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于A組,差異均

12、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);B組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、慢性腦缺血可引起少突膠質(zhì)細(xì)胞減少,髓鞘脫失,星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)性增生,以及相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　 2、EGb761可減輕慢性腦缺血時(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性損傷,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度反應(yīng)性增生,以及由此引起的髓鞘脫失和認(rèn)知功能障礙。
　　 3、EGb761在慢性腦缺血時(shí)既可以