芹菜素對大鼠腦缺血半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及意義.pdf

1、目的:1.建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,探索小膠質(zhì)細(xì)胞的來源。
　　 2.探討芹菜素對局灶性大鼠腦缺血/再灌注損傷半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及意義。
　　 方法:采用線栓法建立大鼠腦缺血(2h)及不同時(shí)間再灌注損傷模型。動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham-operated,S,n=13)、模型組(Model,M,n=65)和芹菜素組(Apigenin,A,n=65)。M組和A組按再灌注時(shí)間不同又分為再灌注6h組(M6h,A6h,

2、n=13)、24h組(M24h,A24h,n=13)、48h組(M48h,A48h,n=13)、72h組(M72h,A72h,n=13)、7d組(M7d,A7d,n=13),各5小組,共11小組。在制作MCAO模型時(shí)和制作后的12h尾靜脈各注射一次羅丹明6G(Rhod6G)。A組于再灌注同時(shí)及其后的每24h腹腔注射11.6×10-3 mol/L芹菜素溶液25mg/kg(0.8ml/100g),S組和M組在相同的時(shí)間注射等體積生理鹽水。各

3、組動物麻醉清醒后及處死前均給予神經(jīng)行為學(xué)評分。每組大鼠各6只觀察至規(guī)定時(shí)間予頸椎脫臼處死,取左側(cè)大腦半球(缺血再灌注側(cè))測腦組織含水量與MDA含量。此外,每組1只大鼠經(jīng)心臟灌注后做腦組織切片,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察腦梗死灶。每組6只大鼠心臟灌注固定后凝集素?zé)晒?FITC-ILB4)組化染色激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)觀察浸潤的單核細(xì)胞及半暗

4、區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia MG)形態(tài)及數(shù)量等的變化情況。
　　 結(jié)果:1.神經(jīng)行為學(xué)評分:S組為0。M組在腦缺血再灌注后72h、7d神經(jīng)行為學(xué)評分較6h和24h均有顯著減小,差別有高度顯著性意義(P<0.01)；M組在腦缺血再灌注后48h神經(jīng)行為學(xué)評分較再灌注6h有減小,差別有顯著性意義(P<0.05)。A組在腦缺血再灌注后7d神經(jīng)行為學(xué)評分較6h和24h均有顯著減小(P<0.01),A組在再灌注后72h神經(jīng)行為學(xué)評分較

5、再灌注24h有減小(P<0.05)。A組與M組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)除6h外,神經(jīng)行為學(xué)評分均有減小(P<0.05)。余各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.腦組織切片TTC染色:S組腦片均紅染,未見白色梗死灶形成:M6h組出現(xiàn)白色梗死灶,位于顳項(xiàng)葉皮層和尾殼核；之后的42小時(shí)梗死灶范圍逐漸擴(kuò)大,M48h組可見較大的尾殼核和額顳頂葉皮層梗死灶的融合,明顯大于M6h、M24h組、M72h組及M7d組:A組梗死灶較相應(yīng)時(shí)間M組均有不同程

6、度的減小,主要表現(xiàn)在皮層。
　　 3.腦組織含水量變化:與S組相比,M組及A組大鼠平均腦含水量在6h時(shí)即明顯升高,72h時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01),7 d時(shí)兩組大鼠的腦含水量基本恢復(fù)正常,與S組相比無明顯差異(P>0.05)。而A組較M組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均有下降,尤以A48h、A72h組較M組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)下降明顯(P<0.01),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.腦組織MDA含量的變化:與S組比較,M組和A組各時(shí)間

7、點(diǎn)MDA含量均有升高(P<0.01),M72h組明顯高于M6h、M24h和M7d組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；A48h組和A72h組與相應(yīng)M組比較有顯著降低(P<0.01或P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.CLSM觀察MCAO后腦內(nèi)單核細(xì)胞的浸潤及半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的變化:MCAO后6h至7d腦內(nèi)均存在ILB4+/Rhod6G+細(xì)胞的浸潤,提示缺血后的大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)一部分小膠質(zhì)細(xì)胞來源于循環(huán)

8、中的單核細(xì)胞。M組與A組ILB4+細(xì)胞數(shù)較S組均明顯增高(P<0.01),于半暗區(qū)聚集；A組與M組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)半暗區(qū)ILB4+細(xì)胞數(shù)比較,A組均低于M組(P<0.05),芹菜素存一定程度上抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。S組MG形態(tài)上呈現(xiàn)高度分枝狀。M組和A組隨著再灌后時(shí)間的延長,MG逐漸活化,形態(tài)由分枝狀向阿米巴樣轉(zhuǎn)變,至48h時(shí)各組MG形態(tài)均以阿米巴樣為主。
　　 6.半暗區(qū)內(nèi)固有小膠質(zhì)細(xì)胞與浸潤細(xì)胞計(jì)數(shù)的比值進(jìn)行比較:半暗區(qū)內(nèi)固有

9、小膠質(zhì)細(xì)胞與浸潤細(xì)胞計(jì)數(shù)的比值即ILB4+/Rhod6G-/ILB4+/Rhod6G+進(jìn)行比較,M組與A組均以72h時(shí)比值最高,提示半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集以腦內(nèi)固有小膠質(zhì)細(xì)胞的增生為主,其中M72h組較M6h、M24h比值明顯增高(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A48h、A72h、A7d組較A6h、A24h組比值增高(P<0.01),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A72h組較A7d組比值增高(P<0.01),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

10、　 7.相關(guān)性分析:半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與腦組織MDA含量呈正相關(guān)(r=0.518,P<0.01)。
　　 結(jié)論:1.缺血后大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)一部分小膠質(zhì)細(xì)胞來源于循環(huán)中浸潤的單核細(xì)胞(Rhod6G+)；
　　 2.急性缺血再灌注腦組織半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增高,與腦MDA含量密切相關(guān)；
　　 3.芹菜素可抑制半暗區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集,減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,降低MDA含量及腦含水量,減輕腦水腫的程度,提示芹菜素在大鼠