富血小板血漿激活PI3K-AKT-NF-kappa-B信號通路促進骨髓間充質干細胞再生及修復功能的相關研究.pdf

1、骨髓間充質干細胞是目前再生醫(yī)學及組織工程中應用廣泛并且最有潛力的治療手段。然而，骨髓間充質干細胞比較難以獲得，并且在移植入體內后常常大量死亡，存活率低下，這是骨髓間充質干細胞在臨床及再生醫(yī)學中大量使用的最大限制。本課題著重研究了富血小板血漿（一種自體源性的復合生長因子）對骨髓間充質干細胞的作用。富血小板血漿通過激活PI3K-AKT-NFκB信號通路，降低了骨髓間充質干細胞在惡劣環(huán)境條件的凋亡，促進了其存活率及其再生的功能。這些作用都是通

2、過促進骨髓間充質干細胞的旁分泌功能完成的。
　　 本課題分體外及體內兩大部分。體外實驗部分主要是通過體外誘導氧化應激，研究富血小板血漿對骨髓間充質干細胞的抗凋亡的作用及其抗凋亡的機制。體內實驗主要研究富血小板血漿處理后的骨髓間充質干細胞移植入皮膚缺損創(chuàng)面后，在體內的存活及其對創(chuàng)面的再生愈合（表皮，真皮，血管等）促進作用。
　　 第一部分、（離體）富血小板血漿激活內在機制對抗骨髓間充質干細胞凋亡
　　 目的：研究離

3、體氧化應激狀態(tài)下，富血小板血漿對抗骨髓間充質干細胞凋亡，促進其存活的現(xiàn)象，同時探討其內在的機制。
　　 方法：
　　 體外誘導氧化應激條件——血清饑餓后雙氧水處理骨髓間充質干細胞，MTT毒性檢測誘導的最佳條件及富血小板血漿的最佳濃度;在最佳誘導條件下，進一步研究富血小板血漿對骨髓間充質的抗凋亡作用，主要采取凋亡檢測、TUNEL染色方法驗證細胞凋亡和凋亡率及TYPAN blue染色法排除細胞存活及存活率;同時研究凋亡蛋白B

4、cl-xl及p-Bad的表達情況。為深入探討其抗凋亡機制，采用免疫細胞化學及ELASA實驗證明富血小板血漿是否具有促進骨髓間充質干細胞旁分泌的作用---主要研究生長因子VEGF和PDGF;同時檢測到富血小板血漿對骨髓間充質干細胞表面受體PDGFR的表達的影響;采用RT-PCR，Western blot，免疫細胞化學深入研究了富血小板血漿是否激活了骨髓間充質干細胞內的信號通路PI3K-AKT-NFκB或JAK/STAT3;通過反證法，阻斷

5、PDGFR、PI3K、AKT，(LY294002，AG1295，SC66)研究富血小板血漿對骨髓間充質干細胞的一系列的作用:包括抗凋亡，促進旁分泌等作用是否改變。
　　 結果：
　　 1、10um/ml的H2O2是體外最佳誘導氧化應激的條件;10％PRP及20％PRP是促進增殖的最佳濃度;
　　 2、通過MTT，APOPTOSIS，TUNEL，TYPAN BLUE等檢測證明了PRP的有效抗凋亡的作用，以10％或者

6、20％的濃度為最佳;
　　 3、檢測細胞內的凋亡蛋白，PRP預處理后的MSC其Bcl-xl表達增高同時p-Bad表達降低，進一步證明PRP的抗凋亡作用;
　　 4、深入研究PRP發(fā)現(xiàn)其誘導MSC的旁分泌的作用(—)VEGF及PDGF的表達都增高;并同時檢測MSC的表面受體PDGF的表達相應增高;
　　 5、PRP預處理激活了信號通路PI3K-AKT-NFκB;6、阻斷整個信號通路，PRP的抗凋亡，促進分泌作用都明

7、顯降低甚至逆反。
　　 結論：10％PRP預處理促進MSC在體外氧化應激條件下（10um/mlH2O2+血清剝奪）抗凋亡的作用，這種抵抗凋亡作用的機制源于激活MSC內在信號通路PI3K-AKT-NFκB，同時促進MSC分泌VEGF及PDGF的作用。
　　 第二部分、研究體內移植富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞體內存活情況及其再生修復作用
　　 目的：研究富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞體內存活及對急性

8、全層皮膚創(chuàng)面缺損的修復及再生能力。
　　 方法：
　　 1.動物模型的建立及分組:SD雄性大鼠24只，8周齡。隨機分為三組。頭一天晚上各組動物禁食，晨起，備皮。甲苯噻嗪（20mg/kg）及克他命（100mg/kg）麻醉。半小時后，手術剪在大鼠背部中央剪去約2.0×2.0cm大小的皮膚組織，制作皮膚全層缺損模型。本實驗動物分組如下，第一組:實驗組，皮下移植富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞;第二組:實驗對照組，移植骨髓

9、間充質干細胞，（無富血小板血漿處理）;第三組:空白對照組，生理鹽水處理。各組細胞或鹽水量均為200ul.細胞濃度為5×106/ml。移植的骨髓間充質干細胞為大鼠來源的GFP陽性MSC。
　　 2.體內移植后檢測細胞的存活率及GFP陽性細胞檢測:分別于創(chuàng)面愈合的第1，3，5，7，12，22天取下全層皮膚包括皮下筋膜及肌肉，制作標本。一半用于GFP陽性細胞檢測。同時運用活體動物成像儀檢測創(chuàng)面熒光信號強度。另一半，用于TUNEL染色，

10、檢測骨髓間充質干細胞的體內凋亡情況。
　　 3.創(chuàng)面愈合情況的檢測及顯微鏡下組織的愈合狀況:創(chuàng)面愈合情況每隔3天觀察一次，并用數(shù)碼相機拍照，計算機處理圖像信息，運用面積計算法計算每次觀察愈合率的情況，創(chuàng)面愈合率=（初始面積一觀察面積）/初始面積×100％。微觀組織愈合率的評估采用馬松染色法，然后在顯微鏡下觀察其創(chuàng)面愈合情況（表皮、真皮愈合）。
　　 4.檢測表皮再生情況及創(chuàng)面生長因子檢測:取第7天及22天的皮膚樣品，制作

11、冰凍切片。lOμm厚度。冰甲醇固定1小時后，0.1％triton X-1OO打孔30分鐘。然后一抗孵育組織切片1小時:（小鼠抗大鼠a-SMA，VEGF兔抗大鼠CK5，PDGF);熒光標記二抗(Alexa Fluor488-conjugated donkey anti-mouse andFITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG)孵育1-2小時。最后DAPI(Sigma Aldrich)復染后，熒光顯微鏡

12、下觀察。隨機選取10個中間區(qū)域進行鏡下評估。
　　 5.機制探討:免疫組織化學染色，檢測各組切片信號通路蛋白的表達情況。同樣取7天及22天的組織，4μm厚度標本制作后，福爾馬林固定，石蠟包埋，梯度脫水后，烘干?？乖迯桶胄r，3％雙氧水處理切片，PBS反復漂洗4-5次后，一抗孵育:rabbit anti-rat p-AKT1，p-PI3K，NF-κB(1:100; EPITOMICS，Abcam)，4度，過夜。第二天，運用辣根過

13、氧化物酶標記的二抗:horseradishperoxidase-coupled goat anti-rabbit IgG(1:1000; Santa Cruz)孵育1-2小時。 PBS洗4-5次，最后蘇木精復染。樹膠封片。顯微鏡下觀察。對比各組蛋白表達情況。
　　 結果：
　　 1.富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞在體內的存活率較單獨移植的干細胞的存活率明顯升高，凋亡率相應降低。
　　 2.富血小板血漿組跟

14、其余兩組對比，創(chuàng)面愈合率明顯升高，組織愈合時間明顯縮短;在細胞移植后第16天，創(chuàng)面幾乎完全愈合。而其余兩組動物創(chuàng)面的愈合率在每個檢測點均與富血小板組相比明顯低下，并且愈合時間偏長。微觀組織愈合狀況:富血小板血漿組，表皮再生情況明顯較其余兩組好，真皮膠原纖維排列規(guī)整，膠原粗大。
　　 3.富血小板血漿組明顯促進創(chuàng)面表皮再生:增強血管再生及密度，（免疫熒光顯示a-SMA及CK5的表達明顯比其余兩組高）;并且創(chuàng)面生長因子濃度VEGF，

15、PDGF也明顯比其余兩組高。
　　 4.信號蛋白的檢測:富血小板血漿組信號通路蛋白的表達比其余兩組高。這跟體外實驗結果相互呼應。證明了體外實驗的假設即:富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞具有更強的生命力和再生能力，并且這種抗凋亡及再生的功能與其細胞內的PI3K-AKT-NF-KB信號通路被激活密切相關。
　　 結論：
　　 富血小板血漿預處理后的骨髓間充質干細胞移植入全層缺損的大鼠創(chuàng)面后，具有較好的存活率，能