地塞米松對(duì)一次、二次打擊急性肺損傷大鼠糖皮質(zhì)激素受體mRNA及細(xì)胞因子的影響.pdf

1、目的： 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭。ALI和ARDS具有性質(zhì)相同的病理生理改變，嚴(yán)重的ALI被定義為ARDS。AIJ/ARDS的病理基礎(chǔ)是由多種炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等)介導(dǎo)的肺臟局部炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)失控所致的肺

2、毛細(xì)血管膜損傷。AIJ/ARDS的高危因素有：直接肺損傷因素，包括：嚴(yán)重肺感染、胃內(nèi)容物吸入、肺挫傷等等；間接肺損傷因素，包括：膿毒癥、嚴(yán)重的非胸部創(chuàng)傷、重癥胰腺炎等等。在臨床上因胃內(nèi)容物誤吸引起的AIJ/ARDS占30％左右，胃內(nèi)容物吸入肺內(nèi)引起急性呼吸窘迫綜合征是臨床所見的嚴(yán)重肺部并發(fā)癥，在行氣管插管或氣管切開時(shí)也會(huì)增加吸入的發(fā)生率。 在ARDS的發(fā)生發(fā)展中，促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的共同作用介導(dǎo)著炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

3、已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，前列腺素E<,1>、肺表面活性物質(zhì)、溴環(huán)己胺醇等對(duì)鹽酸吸入性肺損傷有一定的保護(hù)作用。盡管目前對(duì)其治療措施有很大進(jìn)展，但ARDS的病死率仍居高不下，約在50％左右，治療方面亟待取得重大突破。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)為一種多途徑抗炎藥物，但是其在.ARDS中的臨床應(yīng)用一直存在爭(zhēng)議，不同原因誘發(fā)的ARDS激素治療效果差異懸殊，幾十年來(lái)一直令臨床醫(yī)師倍感困惑。糖皮質(zhì)激素具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能，同時(shí)對(duì)

4、細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用，糖皮質(zhì)激素的這些作用都是由糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptoL GR)介導(dǎo)的，而作為蛋白質(zhì)的GR則是通過細(xì)胞內(nèi)的基因組機(jī)制由糖皮質(zhì)激素受體mRNA翻譯而來(lái)。由于ALI/ARDS的病因復(fù)雜，不同病因的ALI/ARDS在病理學(xué)和病理生理學(xué)上有許多相似之處，但其病情的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的差別很大，所以對(duì)糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)性差異也極大。我們建立了鹽酸(Hydrochloric acid，

5、HCl)吸入的"一次打擊"和靜脈應(yīng)用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)后冉合并HCl吸入的"二次打擊"ALI動(dòng)物模型，比較肺組織上糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達(dá)水平，血清細(xì)胞因子中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-lbeta，IL-1β)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-10(interleukin-10，

6、IL-10)的水平及地塞米松(Dexamethasone，DEX)干預(yù)后對(duì)其水平的影響，假設(shè)經(jīng)糖皮質(zhì)激素干預(yù)后兩種動(dòng)物模型可能存在一定的差別，探討糖皮質(zhì)激素干預(yù)對(duì)不同誘因?qū)е碌募毙苑螕p傷大鼠的糖皮質(zhì)激素受體mRNA和細(xì)胞因子改變影響的差異與機(jī)理，為臨床上選擇性應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療由于肺內(nèi)外復(fù)合因素導(dǎo)致的ARDS，特別是為胃液吸入相關(guān)性ARDS的治療提供理論依據(jù)。 方法： 試驗(yàn)用雄性SD大鼠48只，體重250-300g，隨

7、機(jī)分為6組：①NS組，②HCl組，③LPS+HCl組，④NS+DEX細(xì)，⑤HCI+DEX組，⑥LPS+HCI+DEX組，每組8只動(dòng)物。④、⑤、⑥三組為激素干預(yù)組。造模結(jié)束后立即腹腔注射DEX(2mg/kg)。①、④二組為對(duì)照組，尾靜脈注射+氣管內(nèi)滴入NS；②、⑤二組為HCl組，氣管內(nèi)滴入pH值為1.8的HCl(2ml/kg)；③、⑥二組為L(zhǎng)PS+HCl組，尾靜脈同部位注入LPS(4mg/kg)4小時(shí)之后氣管內(nèi)再滴入pH值為1.8的HCl

8、(0.5ml/kg)。復(fù)制模型后4小時(shí)，每組8只動(dòng)物，10％水合氯醛腹腔注射麻醉(4ml/kg)，經(jīng)開胸心臟抽血處死動(dòng)物，收集血液，離心(3000rpm，4℃，10min)，吸取上清，-80℃保存，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的含量。用兩把止血鉗鉗夾右主支氣管根部，在兩鉗間切斷主支氣管取下右肺，其中稱取右肺前葉100mg保存于-80℃冰箱，用于肺組織總RNA的提取，再行RT-PCR；右肺下葉用10％的中性福爾馬

9、林液固定，常規(guī)石蠟包埋做病理切片，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化并評(píng)分；其余的兩葉用于濕重/干重(wet weight/dry weight，W/D)的測(cè)定(80℃，48h)。左肺經(jīng)氣管插管行左肺支氣管肺泡灌洗，取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，離心(1200rpm，4℃，10min)，吸取上清，-80℃保存，檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的含量和蛋白水平。細(xì)

10、胞沉淀懸浮于等量生理鹽水中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。 結(jié)果： 1、HCl組和LPS+HCl組BALF中細(xì)胞總數(shù)高于NS組(P<0.01)。HCI+DEX組和HCl組細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯差異。LPS+HCl+DEX組和LPS+HCl組細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯差異。HCl組和LPS+HCl組BALF中PMN％高于NS組(P<0.01)。LPS+HCI+DEX組較LPS+HCl組BALF中PMN％降低(P<0.01)，HCI+DEX組

11、和HCl組PMN％無(wú)明顯差異。 2、HCI組和LPS+HCl組肺組織GRmRN/β-actinmRNA顯著低于NS組(P<0.01)。LPS+HCI+DEX組GRmRNA/β-actinmRNA較LPS+HCL組升高(P<0.05)。HCI+DEX組和HCl組無(wú)明顯差異。 3、HCl組和LPS+HCl組肺W/D和BALF中蛋白含量均顯著高于NS組(P<0.05)。LPS+HCI+DEX組肺W/D較LPS+HCl組降低(P

12、<0.05)。HCI+DEX組BALF中蛋白含量較HCl組有明顯降低(P<0.05)。 4、HCl組和LPS+HCl組血清和BALF中TNF-α均較NS組有明顯升高(P<0.01、)。LPS+HCI+DEX組血清和BALF中TNF-α較LPS+HCl組有明顯降低(P<0.05)。所有組血清中IL-1β含量未測(cè)得。HCl組和LPS+HCl組BALF中IL-1β均較NS組有明顯升高(P<0.05)。 5、HCl組和LPS+H

13、Cl組血清和BALF中IL-4、IL-10含量均顯著高于NS組(P<0.05)。LPS+HCI+DEX組和LPS+HCl組血清和BALF中IL-4含量無(wú)顯著差異。LPS+HCI+DEX組血清中IL-10較LPS+HCl組有明顯升高(P<0.05)。HCI+DEX組BALF中IL-10較HCl組有明顯升高(P<0.01)。LPS+HCI+DEX組BALF中IL-10較LPS+HCl組有明顯升高(P<0.01、)。光鏡(LM)下結(jié)果表明：

14、 HCl組和LPS+HCl組肺體積增大，明顯水腫，肺表面可見點(diǎn)灶狀出血，光鏡下觀察均可見肺間質(zhì)及肺泡腔水腫、滲出、出血等病理變化，病理積分無(wú)明顯差異。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。GCs干預(yù)組與非GCs干預(yù)組比較用t檢驗(yàn)，不同模型組組間比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、氣管內(nèi)滴入HCl的"一次打擊"和靜脈注射LPS再氣管內(nèi)滴入HCl的"二