肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良2A型的病理和分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的：肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Limb-girdle musculardystrophy,LGMD)是一組以肢體近端肌無(wú)力及萎縮為主要臨床表現(xiàn)，以肌纖維變性、壞死和再生為主要病理表現(xiàn)的慢性進(jìn)行性加重的遺傳性疾病。屬于進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良(Progressive muscular dystrophy，PMD)范疇，根據(jù)遺傳形式和致病基因分為常染色體顯性遺傳(LGMD1A～1G)和常染色體隱性遺傳(LGMD2A～2L)。LGMD2A的致病基因是CAP

2、N3，編碼蛋白為calpain-3，基因變異導(dǎo)致該蛋白表達(dá)異常，引起LGMD的臨床和病理表現(xiàn)。本研究通過(guò)LGMD2A患者的骨骼肌活檢，組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，westernblotting分析，探討LGMD2A的病理和分子生物學(xué)特點(diǎn)，以及可能的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)研究calpain-3與其他PMD相關(guān)蛋白的關(guān)系。 方法：選取10例LGMD2A患者的骨骼肌活檢標(biāo)本，7μm或10μm冰凍連續(xù)切片。 1 組織化學(xué)染色：包括蘇木精

3、-伊紅(Hematoxylin andEosin，HE)、改良GT三色(Modified Gomori trichrome，MGT)、還原型輔酶Ⅰ四唑氮還原酶(Nicotinamide AdenineDinucleotide Tetra-zolium Reductase，NADH-TR)、細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase，CCO)、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)、單磷酸腺

4、苷脫氨酶(AMPdeaminase)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)、三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase，ATPase酸性/堿性)、過(guò)碘酸雪夫氏(periodic acid schiff,PAS)、油紅O(Oil red O)、蘇丹藍(lán)(Sudan blue)。 2 免疫組織化學(xué)染色(杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者2例，LGMD2B患者2例作為對(duì)照)：抗dystrophin-N、-C、-R，sarcogl

5、ycan-α、-β、-γ、-δ，dysferlin，caveolin-3單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色。 3 Western blotting：抗calpain-3和caveolin-3單克隆抗體標(biāo)記的western blotting分析。 結(jié)果： 1 LGMD2A組織化學(xué)、酶學(xué)染色病理特點(diǎn)：肌纖維大小不一，不同程度變性、壞死和再生，結(jié)締組織增生；NADH-TR、CCO、SDH染色，部分肌纖維酶活性局灶性缺失，可見(jiàn)分

6、葉肌纖維；AMP染色，酶活性正常；酸性磷酸酶染色，變性肌纖維和炎性細(xì)胞內(nèi)酶活性增高，呈紅染；ATPase染色Ⅰ、Ⅱ型肌纖維呈鑲嵌狀分布，偶有肌纖維優(yōu)勢(shì)、肌纖維群萎縮等神經(jīng)源性病理改變；PAS染色，肌纖維內(nèi)糖原成分正常；油紅O、蘇丹藍(lán)染色，部分肌纖維內(nèi)脂滴增多。 2 免疫組織化學(xué)染色病理特點(diǎn)：抗dystrophin-N、-C、-R，sarcoglycan-α、-β、-γ、-δ，dysferlin，caveolin-3單克隆抗體染色

7、，LGMD2A患者肌纖維相應(yīng)蛋白均呈深棕色染，正常表達(dá)；杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者dystrophin-N、-C、-R在肌纖維膜上完全缺失，sarcoglycan-α、-β、-γ、-δ表達(dá)減弱，dysferlin和caveolin-3正常表達(dá)；LGMD2B患者dysferlin在肌纖維和胞漿內(nèi)完全缺失，其他蛋白均表達(dá)良好。 3 Western blotting分析：與對(duì)照例相比，10例患者94kd區(qū)域目的條帶(calpain-3)完全

8、缺失，30kd附加條帶弱表達(dá)，22kd區(qū)域條帶(caveolin-3)均正常表達(dá)。 結(jié)論： 1 LGMD2A主要臨床表現(xiàn)：符合LGMD的一般臨床表現(xiàn)，缺乏特異性。兒童或成人期起病，多有陽(yáng)性家族史，首先累及肢體近端肌，以下肢肌無(wú)力、萎縮多見(jiàn)，進(jìn)展緩慢，肌酸激酶輕-重度升高，肌電圖呈肌源性改變。 2 骨骼肌活檢組織化學(xué)染色：呈肌營(yíng)養(yǎng)不良性病理改變。不同程度肌纖維變性、壞死和再生，慢性病程可見(jiàn)肌纖維分裂現(xiàn)象，結(jié)締組織增

9、生；NADH-TR、CCO、SDH染色可見(jiàn)分葉狀肌纖維等酶活性異常表現(xiàn)。 3 免疫組織化學(xué)染色：抗dystrophin，sarcoglycan，dysferlin，caveolin-3單克隆抗體染色，相應(yīng)蛋白均正常表達(dá)，可依次除外杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良/貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良、LGMD2C～2F、LGMD2B和LGMDlC的診斷，提示10例患者calpain-3與上述蛋白無(wú)相關(guān)性。 4 Western blotting：10例LGM