先心病肺動脈高壓生物標記物篩選和動物模型構建.pdf

1、目的：肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是先天性心臟?。╟ongenital heart disease,CHD）的常見并發(fā)癥，CHD重度PAH術后部分患者肺動脈壓力仍維持在較高水平，甚至繼續(xù)升高，嚴重影響了患者的生活質量，然而目前的臨床檢查手段難以區(qū)分肺血管病變是否可逆。本課題擬通過microRNA芯片技術，比較CHD術后可逆性PAH和不可逆PAH（irreversible PAH，i

2、PAH）患者血漿中microRNA的表達譜，旨在發(fā)現(xiàn)能夠區(qū)別PAH和 iPAH的特異性的 microRNA。同時我們擬構建小鼠腹腔分流型重度PAH模型，為進一步深入研究重度PAH提供平臺。
　　方法：以2011年10月1日－2012年9月30日在上海兒童醫(yī)學中心就診的CHD重度PAH患者為研究對象。根據(jù)治療后6月患者隨訪的平均肺動脈壓力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）將患者分為3組：m

3、PAP≥50 mmHg為iPAH組，25mmHg≤mPAP≤50 mmHg為可逆性PAH組（簡稱為PAH組），mPAP＜25mmHg的CHD患者（治療前mPAP＜25mmHg）為對照組。其中10例患者（對照組3例，PAH組3例，iPAH組4例）的血漿標本通過microRNA芯片技術篩選，30例患者（對照組12例，PAH組10例，iPAH組8例）的血漿標本進行microRNA芯片結果的驗證。
　　將雄性C57/BL6小鼠隨機分為傳統(tǒng)

4、針扎小分流組(n=32)，其中4周末組、6周末組、8周末組、12周末組各8只；間隔剪開大分流組(n=32)，其中4周末組、6周末組、8周末組、12周末組各8只、假手術組(n=8)和正常對照組(n=8)。傳統(tǒng)針扎小分流組采用注射針頭進行造瘺，間隔剪開大分流組采用直接剪開腹主動脈下腔靜脈間隔制作腹腔動靜脈分流。傳統(tǒng)針扎小分流組和間隔剪開大分流組4周末、6周末、8周末、12周組測小鼠右心室收縮壓和右心室肥厚指數(shù)，通過右心室收縮壓評估肺動脈收縮

5、壓。通過HE染色和VG染色觀察肺血管的形態(tài)學改變。用CD-31標記內(nèi)皮細胞，α-SMA標記平滑肌細胞，通過免疫熒光技術觀察重度PAH肺血管重構的特點。
　　結果：本課題通過microRNA芯片技術比較了CHD重度PAH患者血漿microRNA的表達，結果顯示 iPAH組表達上調(diào)的microRNA有7個，分別為miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a、miR-1、miR-34a，下調(diào)的

6、有3個，miR-20b、miR-500a、miR-501-3p。我們選取了表達差異最顯著的5個microRNA（miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a）運用Real Time-PCR進行驗證，結果與芯片結果基本相符合，其中iPAH組miR-145、miR-126、miR-374a的表達明顯高于PAH組（p＜0.01，p=0.003，p=0.007）和正常組（p＜0.05）。iPAH組mi

7、R-145、miR-126的表達倍數(shù)比PAH高2倍。
　　我們運用腹腔分流法成功建立了小鼠重度PAH模型。間隔剪開大分流組的分流通暢率比傳統(tǒng)針扎小分流組的通暢率明顯提高(P<0.01)；間隔剪開大分流組小鼠肺動脈壓力和右心室肥厚指數(shù)比其余各組均明顯升高(P<0.05)；HE染色和 VG染色可觀察到間隔剪開大分流組和傳統(tǒng)針扎小分流組小鼠的平滑肌層明顯增厚，平均中膜厚度百分比進行性減少，間隔剪開大分流組的平均中膜厚度百分比與其余各組均

8、明顯升高(P<0.01)。免疫熒光檢測顯示傳統(tǒng)針扎小分流組肺血管平滑肌細胞增殖，間隔剪開大分流組肺血管平滑肌細胞增殖、內(nèi)皮細胞增生，與臨床重度PAH患者的肺血管重構相符。
　　結論：通過microRNA芯片篩選和進一步的驗證，我們得出miR-145、miR-126可區(qū)分PAH和iPAH，并且可能跟重度PAH肺血管重構有著密切的關系。直接剪開腹主動脈下腔靜脈間隔的方法建立小鼠PAH模型，可以建成與臨床患者相符的重度PAH模型，為臨床