先心病肺動(dòng)脈高壓生物標(biāo)記物篩選和動(dòng)物模型構(gòu)建.pdf

1、目的：肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是先天性心臟?。╟ongenital heart disease,CHD）的常見(jiàn)并發(fā)癥，CHD重度PAH術(shù)后部分患者肺動(dòng)脈壓力仍維持在較高水平，甚至繼續(xù)升高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，然而目前的臨床檢查手段難以區(qū)分肺血管病變是否可逆。本課題擬通過(guò)microRNA芯片技術(shù)，比較CHD術(shù)后可逆性PAH和不可逆PAH（irreversible PAH，i

2、PAH）患者血漿中microRNA的表達(dá)譜，旨在發(fā)現(xiàn)能夠區(qū)別PAH和 iPAH的特異性的 microRNA。同時(shí)我們擬構(gòu)建小鼠腹腔分流型重度PAH模型，為進(jìn)一步深入研究重度PAH提供平臺(tái)。
　　方法：以2011年10月1日－2012年9月30日在上海兒童醫(yī)學(xué)中心就診的CHD重度PAH患者為研究對(duì)象。根據(jù)治療后6月患者隨訪的平均肺動(dòng)脈壓力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）將患者分為3組：m

3、PAP≥50 mmHg為iPAH組，25mmHg≤mPAP≤50 mmHg為可逆性PAH組（簡(jiǎn)稱為PAH組），mPAP＜25mmHg的CHD患者（治療前mPAP＜25mmHg）為對(duì)照組。其中10例患者（對(duì)照組3例，PAH組3例，iPAH組4例）的血漿標(biāo)本通過(guò)microRNA芯片技術(shù)篩選，30例患者（對(duì)照組12例，PAH組10例，iPAH組8例）的血漿標(biāo)本進(jìn)行microRNA芯片結(jié)果的驗(yàn)證。
　　將雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為傳統(tǒng)

4、針扎小分流組(n=32)，其中4周末組、6周末組、8周末組、12周末組各8只；間隔剪開(kāi)大分流組(n=32)，其中4周末組、6周末組、8周末組、12周末組各8只、假手術(shù)組(n=8)和正常對(duì)照組(n=8)。傳統(tǒng)針扎小分流組采用注射針頭進(jìn)行造瘺，間隔剪開(kāi)大分流組采用直接剪開(kāi)腹主動(dòng)脈下腔靜脈間隔制作腹腔動(dòng)靜脈分流。傳統(tǒng)針扎小分流組和間隔剪開(kāi)大分流組4周末、6周末、8周末、12周組測(cè)小鼠右心室收縮壓和右心室肥厚指數(shù)，通過(guò)右心室收縮壓評(píng)估肺動(dòng)脈收縮

5、壓。通過(guò)HE染色和VG染色觀察肺血管的形態(tài)學(xué)改變。用CD-31標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，α-SMA標(biāo)記平滑肌細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察重度PAH肺血管重構(gòu)的特點(diǎn)。
　　結(jié)果：本課題通過(guò)microRNA芯片技術(shù)比較了CHD重度PAH患者血漿microRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示 iPAH組表達(dá)上調(diào)的microRNA有7個(gè)，分別為miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a、miR-1、miR-34a，下調(diào)的

6、有3個(gè)，miR-20b、miR-500a、miR-501-3p。我們選取了表達(dá)差異最顯著的5個(gè)microRNA（miR-301a-3p、miR-145、miR-126、miR-26a、miR-374a）運(yùn)用Real Time-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符合，其中iPAH組miR-145、miR-126、miR-374a的表達(dá)明顯高于PAH組（p＜0.01，p=0.003，p=0.007）和正常組（p＜0.05）。iPAH組mi

7、R-145、miR-126的表達(dá)倍數(shù)比PAH高2倍。
　　我們運(yùn)用腹腔分流法成功建立了小鼠重度PAH模型。間隔剪開(kāi)大分流組的分流通暢率比傳統(tǒng)針扎小分流組的通暢率明顯提高(P<0.01)；間隔剪開(kāi)大分流組小鼠肺動(dòng)脈壓力和右心室肥厚指數(shù)比其余各組均明顯升高(P<0.05)；HE染色和 VG染色可觀察到間隔剪開(kāi)大分流組和傳統(tǒng)針扎小分流組小鼠的平滑肌層明顯增厚，平均中膜厚度百分比進(jìn)行性減少，間隔剪開(kāi)大分流組的平均中膜厚度百分比與其余各組均

8、明顯升高(P<0.01)。免疫熒光檢測(cè)顯示傳統(tǒng)針扎小分流組肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，間隔剪開(kāi)大分流組肺血管平滑肌細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞增生，與臨床重度PAH患者的肺血管重構(gòu)相符。
　　結(jié)論：通過(guò)microRNA芯片篩選和進(jìn)一步的驗(yàn)證，我們得出miR-145、miR-126可區(qū)分PAH和iPAH，并且可能跟重度PAH肺血管重構(gòu)有著密切的關(guān)系。直接剪開(kāi)腹主動(dòng)脈下腔靜脈間隔的方法建立小鼠PAH模型，可以建成與臨床患者相符的重度PAH模型，為臨床