IL-1β和PGE-,2-在煙霧吸入性損傷修復(fù)中作用的實驗研究.pdf

1、研究背景與總體思路：
　　 吸入性損傷是燒傷病人常見的合并損傷,其中煙霧是最常見的致傷因素。當(dāng)吸入性損傷出現(xiàn)后機(jī)體將立即啟動損傷修復(fù)過程以保證肺的正常功能,損傷后可能會完全修復(fù),也可能會導(dǎo)致氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄,從而引起患者呼吸困難,生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。怎樣盡早促進(jìn)吸入性損傷修復(fù)和預(yù)防損傷修復(fù)后氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄?是一個臨床上非常棘手的問題,目前研究熱點主要集中在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子在氣道粘膜損

2、傷修復(fù)過程中的作用。氣道損傷修復(fù)是一個非常復(fù)雜的過程,多種細(xì)胞類型主要為氣道上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)成分共同參與,這個過程中可出現(xiàn)纖維化、瘢痕形成,導(dǎo)致氣道狹窄。目前研究表明在氣道損傷修復(fù)過程中,炎癥反應(yīng)是一個必不可少的部分,它可以促進(jìn)損傷盡早修復(fù),但是過度炎癥反應(yīng)與損傷修復(fù)的后果,尤其是與纖維化瘢痕形成密切相關(guān);另一方面,在胎兒的損傷修復(fù)中研究發(fā)現(xiàn)減少對損傷的炎癥反應(yīng)與缺乏瘢痕形成和纖維化的再生修復(fù)過程相關(guān)。以往

3、研究還表明成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源,它的募集、聚集與激活影響損傷后組織的正常愈合和纖維化形成的過程,在損傷部位,炎癥與成纖維細(xì)胞活性的關(guān)系可能對損傷修復(fù)的最終后果和瘢痕形成程度起重要作用,因此,研究炎癥因子與氣道成纖維細(xì)胞在氣道粘膜損傷修復(fù)中的作用,對促進(jìn)氣道損傷早日修復(fù)及防止損傷修復(fù)后氣道狹窄具有重要意義。
　　 白介素-1β(IL-1β),是一種多功能的生物活性物質(zhì),被認(rèn)為是早期炎癥反應(yīng)中重要的炎癥介質(zhì),可由各種細(xì)胞

4、包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。在損傷部位IL-1β分泌可刺激IL-6、IL-8、PGE2分泌,這些炎癥介質(zhì)是使損傷部位活動協(xié)調(diào)的整合炎癥反應(yīng)中的一個部分。前列腺素E2(PGE2)是一個輔助性炎癥介質(zhì),通過環(huán)氧合酶合成、由PGE2合酶激活、被多種酶包括脫氫酶降解。在組織修復(fù)中,PGE2是參與調(diào)節(jié)炎癥與纖維化的重要炎癥介質(zhì),它通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞遷移率來抑制成纖維細(xì)胞趨化性,通過阻斷成纖維細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生來影響成纖維

5、細(xì)胞在損傷修復(fù)中基質(zhì)收縮與重構(gòu)中的作用。PGE2在損傷修復(fù)過程中早、晚期階段表達(dá),它能抑制纖維化反應(yīng),包括膠原產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)收縮及成纖維細(xì)胞增殖,還能刺激上皮細(xì)胞遷移,參與損傷修復(fù)這一階段。為此我們設(shè)想,IL-1β和PGE2在氣道粘膜損傷修復(fù)過程中可能起重要作用,可能為臨床上判斷氣道粘膜損傷修復(fù)過程不同階段提供新的手段;對促進(jìn)氣道粘膜損傷盡早修復(fù)和預(yù)防損傷修復(fù)后氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄提供一定的理論依據(jù)。
　　 本研究的

6、總體思路為:
　　 首先,建立煙霧吸入性損傷修復(fù)動物(新西蘭白兔)模型,通過檢測氣道分泌物IL-1β、PGE2和病理改變以及IL-1βmRNA、COX-2mRNA表達(dá),旨在明確
　　 ①損傷修復(fù)過程中不同階段(損傷期和修復(fù)期);
　　 ②IL-1β、PGE2在煙霧吸入氣道粘膜損傷修復(fù)過程中不同時間點水平變化與病理改變的關(guān)系,可能為臨床上判斷氣道粘膜損傷修復(fù)過程不同階段提供檢測手段;
　　 ③IL-1βmR

7、NA、COX-2mRNA表達(dá)變化與病理改變之間的關(guān)系。
　　 然后,根據(jù)上部分的研究結(jié)果,以原代氣道成纖維細(xì)胞為研究對象,觀察IL-1β和PGE2之間的相互關(guān)系,利用ELISA法測定PGE2水平和Western印跡法檢測各項指標(biāo)COX-2、mPGES1、EP2與15-PGDH表達(dá)。從細(xì)胞和分子生物學(xué)水平,研究IL-1β對氣道成纖維細(xì)胞PGE2表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討IL-1β、PGE2在吸入性損傷修復(fù)中的作用。
　　 第一

8、部分(體內(nèi)實驗)、煙霧吸入性損傷修復(fù)模型IL-1β和PGE2表達(dá)的變化
　　 目的:探討IL-1β和PGE2在新西蘭白兔煙霧吸入性損傷氣道修復(fù)中表達(dá)變化,及其與病理改變的關(guān)系。
　　 方法：新西蘭白兔36只,隨機(jī)分為正常對照組、煙霧吸入性損傷后第1、4、7、14和21d組,共6組,各組依次收集氣道分泌物和常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色做病理切片,應(yīng)用ELISA和RT-PCR方法檢測各組IL-1β、PGE2及COX-2表達(dá)。建

9、立煙霧吸入性損傷修復(fù)模型,光鏡下觀察煙霧吸入對實驗兔氣管、肺組織的病理變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①病理變化表明煙霧吸入性損傷第1、4、7d組以損傷后炎癥反應(yīng)為主(損傷期),第14、21d組以損傷后修復(fù)為主(修復(fù)期),這表明煙霧吸入性損傷修復(fù)模型成功建立;
　　 ②ELISA結(jié)果表明:IL-1β含量在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,至第21d最低,損傷期第7d組(253.3±96.2)與修復(fù)期第14d組(96.2

10、±67.8)比較有顯著差異(P＜0.01);PGE2含量在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,至第21d達(dá)到頂峰,修復(fù)期第14d組(85521±24015)與損傷期第7d組(32486±19811)比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　 ③RT-PCR結(jié)果表明:IL-1βmRNA表達(dá)在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,損傷期第1、4d組IL-1βmRNA表達(dá)明顯高于修復(fù)期第14、21d組,第4d組(1.75±0.31)與第14d組(0

11、.75±0.33)比較有顯著性差異(P＜0.01);COX-2mRNA表達(dá)在煙霧吸入性損傷后第1d升高,在第21d達(dá)到最高,修復(fù)期第14、21d組(COX-2mRNA表達(dá)明顯高于損傷期第1、4d組,第14d組(1.86±0.31)與第1d組(1.03±0.26)比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：通過建立煙霧吸入性損傷修復(fù)模型,觀察IL-1β和PGE2的動念變化,發(fā)現(xiàn)IL-1β在損傷期水平明顯上調(diào),而PGE2在修復(fù)期

12、水平更高,這說明IL-1β與PGE2可能與煙霧吸入性損傷修復(fù)過程中病理變化具有相關(guān)性,可能為臨床上判斷煙霧吸入性損傷修復(fù)過程不同階段(損傷期、修復(fù)期)提供幫助。
　　 第二部分(體外實驗)、IL-1β對氣道成纖維細(xì)胞PGE2表達(dá)的影響
　　 目的:研究IL-1β對小鼠氣道成纖維細(xì)胞PGE2表達(dá)的影響,以探討其在吸入性損傷修復(fù)中的作用。
　　 方法：分離雄性昆明種小鼠的氣道成纖維細(xì)胞細(xì)胞并體外培養(yǎng),分別收集IL-1

13、β作用后不同時間點和不同濃度的IL-1β作用后的培養(yǎng)上清液及細(xì)胞:采用ELISA法和western blot技術(shù)測定PGE2水平,COX-2、mPGES1、EP2與15-PGDH蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 ①經(jīng)IL-1β1ng/ml處理后不同時間點氣道成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平在8h(148.2±28.3pg/ml)、16h(267.6±45.4pg/ml)、24h(210.5±38.6pg/ml)、48h(1

14、98.7±36.5pg/ml)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h水平最高;氣道成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)在8h(0.478±0.029)、16h(0.672±0.047)、24h(0.617±0.036)、48h(0.593±0.034)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h表達(dá)水平最高:氣道成纖維細(xì)胞mPGES1的表達(dá)在8h(0.300±0.018)、16h(0.549±0.034)、24h(0.497±O.030)

15、、48h(0.443±0.026)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h表達(dá)水平最高;氣道成纖維細(xì)胞EP2、15-PGDH的表達(dá)在8h、16h、24h、48h與各對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ②不同濃度IL-1β處理氣道成纖維細(xì)胞后,氣道成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平在IL-1β0.1ng/ml組(142.9±22.3pg/ml)、1ng/ml組(267.6±45.4pg/ml)和10ng/ml組(

16、587.3±106.9pg/ml)均顯著高于對照組(58.5±16.0pg/ml)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01);氣道成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)在IL-1β0.1ng/ml組(0.525±0.031)、1ng/ml組(0.672±0.047)和10ng/ml組(1.012±0.064)均顯著高于對照組(0.309±+0.019)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01);氣道成纖

17、維細(xì)胞mPGES1表達(dá)在IL-1β0.1ng/ml組(0.380±0.021)、1ng/ml組(0.549±0.034)和10ng/ml組(0.879±0.045)均顯著高于對照組(0.199±0.012)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01):氣道成纖維細(xì)胞EP2、15-PGDH的表達(dá)在IL-1β0.1ng/ml組、1ng/ml組和10ng/ml組與對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。