miR-146a在煙霧吸入性損傷中調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的：
　　煙霧吸入性損傷的病死率高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要是肺內(nèi)炎癥細(xì)胞膜上的NF-κB信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子釋放，促使炎癥反應(yīng)失控，導(dǎo)致ALI/ARDS的發(fā)生。miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，可識(shí)別結(jié)合靶基因的3ˊ-UTR，導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯。miR-146a通過(guò)靶向TRAF6和IRAK1阻斷NF-κB活化，負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，在煙霧吸入性損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中， miR-146

2、a是否靶定TMEM33來(lái)減輕肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍緦?shí)驗(yàn)依據(jù)miR-146a預(yù)測(cè)靶點(diǎn)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒并進(jìn)行功能驗(yàn)證，通過(guò)小鼠煙霧損傷模型觀察miR-146a對(duì)炎癥因子和蛋白表達(dá)水平的影響，試圖證實(shí)miR-146a通過(guò)靶向TMEM33減輕肺部炎癥反應(yīng)，提高ALI/ARDS的治療效果。
　　方法：
　　1.利用生物學(xué)軟件TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)TMEM33 mRNA3ˊ-UTR區(qū)可能是

3、miR-146a的作用靶點(diǎn)，構(gòu)建含TMEM33 mRNA3ˊ-UTR熒光報(bào)告質(zhì)粒，雙熒光素酶活性檢測(cè)驗(yàn)證miR-146a與TMEM33的標(biāo)靶關(guān)系；
　　2.選擇SPF級(jí)C57小鼠20只，雌雄不限，建立小鼠煙霧吸入性損傷模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、煙霧致傷+生理鹽水組、煙霧致傷+miR-146a組、煙霧致傷+miR-control組，每組5只，煙霧吸入性損傷24h后處死小鼠取肺組織，右肺采用HE染色檢測(cè)肺損傷程度；采用探針PCR檢測(cè)各

4、組miR-146a的相對(duì)表達(dá)量，采用熒光定量PCR檢測(cè)各組TNF-α、IL-1和靶基因mRNA的表達(dá)；左肺行Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組COX-2和TMEM33蛋白的水平。
　　結(jié)果：
　　1. TargetScan等軟件預(yù)測(cè)顯示miR-146a與TMEM33mRNA3ˊ-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)顯示，與pMIR-TMEM33+miR-control組相比，

5、pMIR-TMEM33+miR-146a mimics組熒光素酶活性降低62％左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而pMIR-TMEM33-mu+miR-146a組熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異（P>0.01）；
　　2. HE染色顯示正常對(duì)照組小鼠肺組織無(wú)明顯異常，煙霧致傷組小鼠肺部出現(xiàn)中重度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及出血等；TaqMan RT-qPCR結(jié)果顯示，相對(duì)于miR-control組miR-146a的表達(dá)量（0.829±0.060），mi

6、R-146a組的表達(dá)量（11.640±0.190）上調(diào)了約10倍（P<0.01）；RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-146a組TNF-α和IL-1mRNA的表達(dá)顯著低于生理鹽水組和miR-control組（P<0.01）；而TMEM33的表達(dá)與生理鹽水組及miR-control組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；Western Blot結(jié)果顯示，與生理鹽水組和miR-control組相比，miR-146a組COX-2及TMEM33表達(dá)相對(duì)