鲇源擬態(tài)弧菌的分離鑒定研究.pdf

1、2012年以來，四川各地南方鲇和溝鲇的養(yǎng)殖場常爆發(fā)一種以體表出現(xiàn)褪色斑，背部、腹部肌肉出現(xiàn)明顯的長方狀潰瘍灶，臀鰭與尾鰭基部出血為特征的傳染病。2012-2014年間，從四川各鲇魚養(yǎng)殖區(qū)自然感染發(fā)病的南方鲇和溝鲇體內(nèi)分離到4株(SCCF03-SCCF06)G-弧形，極生單鞭毛短桿菌。在TSA平板于28℃培養(yǎng)48h，形成表面光滑，邊緣整齊，微隆起，乳白色的圓形菌落，在鑒別培養(yǎng)基TCBS上則形成綠色菌落。在光學顯微鏡下，4分離菌呈G-短桿菌

2、，菌體稍彎，呈弧形或逗點狀;電鏡下可見菌體極生單鞭毛;生理生化特性與弧菌屬細菌極為相似。根據(jù)分離菌株的形態(tài)學和生理生化特性初步判定其為弧菌（Vibrio sp）;16S rDNA與gyrB序列分析表明，4分離株16S rDNA序列(KC503057、KC503059、KJ001822、KF907127)與GenBank中V.cholerae16S rDNA序列同源性最高;而gyrB序列(KC503058、KC503060、KC50305

3、4、KF998569)與V.mimicus gyrB序列同源性最高。在以分離菌16S rDNA序列及其GenBank中同源性較高的相關序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，4分離菌與V.cholerae和V.mimicus聚為一族;在以gyrB基因序列及其GenBank中同源性較高的相關序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，4分離株與V.mimicus聚為一族。在基于弧菌系統(tǒng)發(fā)育標志性鑒別基因dnaJ的雙重PCR檢測中，4分離株基因組DNA中均特異性擴增出大小約為

4、177 bp條帶，與預期V.mimicus擴增片段一致，進而鑒定4株分離菌為V.mimicus。藥物敏感性實驗結(jié)果顯示4株V.mimicus對鏈霉素、丁胺卡那、氟哌酸、氟苯尼考和氧氟沙星等抗菌藥物敏感，對青霉素和羅紅霉素等耐藥。病理學觀察發(fā)現(xiàn)，V.mimicus感染鲇魚對多組織器官都造成明顯的病理損傷，尤其是肌肉、肝、脾、腎的損傷較為嚴重，表現(xiàn)為明顯的出血、變性和壞死以及炎癥細胞浸潤等。
　　對分離的4株V.mimicus的多種毒

5、力基因txA、zot、ace、tcpA、toxR、ompU和vmh進行檢測，結(jié)果顯示鲇源V.mimicus都攜有ompU和vmh兩種毒力因子，而不具有txA、zot、ace、tcpA和toxR。以SCCF06菌株為研究對象，對其vmh基因全序列進行PCR擴增、克隆并測序，應用生物信息學軟件分析vmh基因的同源性及其編碼氨基酸的分子特征。結(jié)果顯示，本研對vmh基因全長序2235 bp，編碼744個氨基酸殘基組成的分子量約為82.85 kD

6、a的蛋白，富含Ser(8.6％)、Ala(7.9％)和Leu(7.7％)，包含Hemolysin.N、RICIN、Leukocidin和Jaclin.like超家族的保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對顯示，vmh基因的核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank中參考株相應序列的同源性分別介于95％～97％和96％-97％。其編碼的氨基酸序列在N端前25個氨基酸形成一個信號肽，7-27位氨基酸之間存在一個跨膜區(qū)，疏水性大于親水性;抗原表位和B細胞表位預測