擬態(tài)弧菌毒素共調(diào)菌毛的檢測及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、首先,應(yīng)用PCR技術(shù)和電鏡技術(shù)對擬態(tài)弧菌HX-4菌株進行TCP檢測.根據(jù)基因文庫中登錄的霍亂弧菌tcpA基因全序列,設(shè)計一對特異性引物,對HX4菌株基因組DNA進行PCR擴增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增片段的長度(617bp)與預(yù)期結(jié)果相符,表明該菌基因組結(jié)構(gòu)中存在tcpA基因.同時采用電鏡技術(shù)檢測TCP,觀察到細(xì)菌表面存在數(shù)量不一,中空、短粗的菌毛.這與國內(nèi)外報道的霍亂弧菌TCP形態(tài)相吻合<'[8~13]>.從而證實了擬態(tài)弧菌HX4菌

2、株為TCP<'+>株,在一定的營養(yǎng)與培養(yǎng)條件下可以表達TCP.其次,采用細(xì)菌學(xué)方法結(jié)合電鏡技術(shù)優(yōu)化擬態(tài)弧菌HX4菌株高表達TCP的最佳營養(yǎng)與培養(yǎng)條件.結(jié)果顯示培養(yǎng)基的種類(AKI、CFA、BHI和LB)、培養(yǎng)溫度(4℃、20℃、30℃和37℃)和培養(yǎng)方式(靜置、厭氧和振蕩培養(yǎng))等環(huán)境參數(shù)對TCP表達均有明顯影響,其最佳表達條件是:細(xì)菌接種初始pH6.7定居因子固體培養(yǎng)基(CFA),30℃需氧靜置培養(yǎng)24h.再次,采用菌毛分離技術(shù)、鹽析技

3、術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠回收技術(shù)建立了擬態(tài)弧菌HX4菌株TCP的提純方法.研究中比較了四種不同脫菌毛緩沖液的洗脫分離菌毛的效果,結(jié)果顯示含2mol/L尿素的0.01mol/L,pH7.2的PBS緩沖液的洗脫效果最佳,其菌毛分離液中蛋白濃度最高,電泳條帶最清晰.在此基礎(chǔ)上進一步比較了3種不同飽和濃度硫酸銨(30％、50％和70％)鹽析沉淀蛋白的效果,結(jié)果顯示硫酸銨飽和度為70％時粗提蛋白含量最高,硫酸銨飽和度為30％時粗提蛋白含量最低.而PAG