Peutz-Jeghers綜合征Axin基因的突變及表達(dá)研究.pdf

1、背景與目的： Peutz-Jehers綜合征(Peutz-Jeghetssyndrome，PJS)是一種以皮膚黏膜黑斑、胃腸道多發(fā)息肉為特征的常染色體顯性遺傳病[1]。早期研究認(rèn)為，PJS息肉為錯構(gòu)瘤或增生性息肉，惡變潛力不大，但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)有PJS息肉為腺瘤樣息肉，可發(fā)生癌變，錯構(gòu)瘤本身也可能演變?yōu)橄倭龊桶?，即存在著由錯構(gòu)瘤→腺瘤→腺癌的演變過程[2]。國內(nèi)外研究表明：PJS患者消化道息肉發(fā)生惡變及在消化道外發(fā)生

2、惡性腫瘤的風(fēng)險明顯高于正常人群[3]。PJS能從錯構(gòu)瘤轉(zhuǎn)變成癌，提示其致病基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 現(xiàn)已知腫瘤形成過程中主要存在著4種不同信號途徑的異常，即Wnt/wingless途徑，K-ras途徑，β-TGF途徑和p53途徑。最新研究表明大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的p53，APC，K-ras12基因，均非PJS息肉發(fā)生、發(fā)展中的重要分子基礎(chǔ)[4]。Wnt通路中癌基因、抑癌基因異常與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此我們

3、著眼于與之可能相關(guān)的Wnt/wingless途徑進(jìn)行研究。Axin(Axisinhibitionprotein)是Wnt通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Axin作為構(gòu)架蛋白，通過Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下調(diào)β-catenin的水平，參與細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控，對抑制腫瘤的發(fā)生起到了重要的作用。 PJS息肉作為錯構(gòu)瘤性息肉，特征性表現(xiàn)為正常細(xì)胞過度生長和組織結(jié)構(gòu)紊亂，可能與不典型增生及腺瘤有著相似的病理基礎(chǔ)。腫瘤抑制因子Axin是否影響PJS息肉的發(fā)生

4、和惡變目前尚無報道。 研究目的： 通過研究PJS患者息肉Axin基因突變及其蛋白表達(dá)，探討Axin基因在PJS息肉發(fā)生及惡變中的作用，為進(jìn)一步臨床診治及預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 1、Axin基因蛋白組織表達(dá)檢測：取PJS息肉、大腸腺瘤、大腸腺癌、大腸正常黏膜組織石蠟標(biāo)本各32例，通過免疫組化二步法檢測Axin蛋白表達(dá)陽性率；選取新鮮PJS息肉組織、大腸腺瘤組織、大腸癌組織及癌旁正常黏膜組織各1

5、6例，采用westernblot方法檢測Axin蛋白表達(dá)水平。 2、Axin基因突變檢測：收集PJS息肉組織、大腸腺瘤組織、大腸腺癌組織、癌旁正常黏膜各16例，針對Axin基因的第2外顯子和第3、4、5外顯子分別設(shè)計1對引物(引物1和引物2)，通過RT-PCR，基因測序，檢測PJS息肉Axin基因突變。 結(jié)果： 1.正常組織、PJS組織、腺瘤組織及腺癌組織中，AXin蛋白胞漿表達(dá)具有顯著差異，胞漿陽性表達(dá)率和表達(dá)

6、強(qiáng)度呈下降趨勢，經(jīng)多組等級資料的秩和檢驗(yàn)方法(Kruskal-WallisH)分析，各組組織中Axin蛋白胞漿陽性表達(dá)率差異具有顯著性(x2=37.036，P=0.000<0.05)；各組組織Axin蛋白相對灰度值(relativeintencity，.Axin/β-actin)分別為正常組織0.719±0.120，PJS息肉0.604±0.091，大腸腺瘤0.358±0.116，大腸腺癌0.246±0.089，經(jīng)OnewayAnova

7、分析，4組間Axin蛋白水平有顯著性差異(F=68.980，P=0.000<0.001)，呈下降趨勢，4組間兩兩比較，差異均具有顯著性(P<0.05)。 2.以引物1行RT-PCR所得產(chǎn)物電泳后經(jīng)Image-ProPlus軟件分析，得到各組組織中Axin基因IOD/內(nèi)參IOD值(AxinIOD／GAPDHIOD)分別為：正常組織0.991±0.120，PJS息肉組織0.794±0.119，大腸腺瘤組織0.598±0.116，大腸

8、癌組織0.313±0.087；同樣分析以引物2行RT-PCR所得的產(chǎn)物，各組組織中Axin基因IOD／內(nèi)參IOD值分別為：正常組織0.894±0.077，PJS息肉組織0.779±0.119，大腸腺瘤組織0.612±0.104，大腸癌組織0.441±0.119。無論使用引物1還是引物2進(jìn)行RT-PCR檢測，4組間呈下降趨勢，經(jīng)OnewayAnova分析，AxinmRNA水平均有顯著性差異(P<0.001)。 3.送檢16例PJS

9、息肉組織樣品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，出現(xiàn)2例編碼區(qū)第254位同義突變，位于第2外顯子，第3.4.5外顯子無突變。 結(jié)論： 1.正常組織、PJS組織、腺瘤組織及腺癌組織中，Axin蛋白胞漿表達(dá)具有顯著差異，胞漿陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度呈下降趨勢，經(jīng)多組等級資料的秩和檢驗(yàn)方法(Kruskal-WallisH)，差異具有顯著性；各組組織Axin蛋白相對灰度值呈下降趨勢，經(jīng)OnewayAnova分析，4組間Axin蛋白水平有顯著性