Peutz-Jeghers綜合征STK11基因胚系突變及STK11、TGFβ1蛋白表達研究.pdf

1、Peutz-Jeghers綜合征（PJS）是一種以皮膚粘膜黑斑、胃腸道多發(fā)息肉為特征的常染色體顯性遺傳病[1]。Hemminki和Jenne幾乎同時在PJS患者和家系中發(fā)現(xiàn)STK11（serine threonine kinase11，絲氨酸/蘇氨酸激酶11）基因胚系突變，證實該基因為本病的主要致病基因。胚系突變與遺傳相關(guān)，在血液DNA水平即可發(fā)生。研究表明，大多數(shù)PJS患者存在STK11基因突變，突變形式以點突變和小片段缺失為主，預期

2、效應是提前出現(xiàn)終止信號，產(chǎn)生截短型蛋白、導致蛋白激酶失活[2'3]。目前發(fā)現(xiàn)STK11（亦稱LKB1）蛋白在染色質(zhì)重構(gòu)、細胞周期、細胞極性以及能量代謝的應答調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，對包括TGFβ/smad通路、NF-κB信號通路、PTEN/磷脂酰肌醇3'磷酸激酶信號通路、G蛋白偶聯(lián)信號通路在內(nèi)的多條通路發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。此外，STK11蛋白能抑制細胞的增殖，促進凋亡。其表達水平的降低，可導致體細胞其它腫瘤相關(guān)基因突變的累積，最終致惡性腫瘤

3、的發(fā)生。 TGFβ（轉(zhuǎn)化生長因子β）是一種由二硫鍵連接的多肽二聚體，其家族成員在哺乳動物體內(nèi)具有相當高的穩(wěn)定性。在機體內(nèi)TGFβ可規(guī)律地控制上皮細胞的生長，間接修復DNA損傷，激發(fā)細胞凋亡，調(diào)節(jié)干細胞功能，具有致癌及抑制腫瘤的雙重特性。TGFβ/Smad通路是TGFβ信號轉(zhuǎn)導的主要途徑，TGFβ與其受體形成受體復合物，激活Smad蛋白，將信號轉(zhuǎn)導至細胞核，行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。TGFβ對不同的細胞有不同的效應，對于成纖維細胞，它

4、的主要作用是刺激細胞分裂；而對于大多數(shù)上皮細胞，卻起生長抑制作用。近年來，大量文獻報道TGFβ信號通路的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。該通路中任一元件的異常都可引起信號轉(zhuǎn)導紊亂，使細胞逃避TGFβ介導的生長抑制效應，導致腫瘤發(fā)生。人類TGFβ家族包括TGFβ1、2、3，三者高度同源，其基因分別位于19q13、1q41、14q24。TGFβ1是細胞和組織中最豐富的TGFβ成員，由于其啟動子的調(diào)控復雜，其失控導致的疾病，包括腫瘤的

5、形成也是最為多見。TGFβ1具有抑制細胞生長的負調(diào)節(jié)生物學效應，其表達或激活方面的缺陷可導致生長抑制作用消失和細胞惡性增殖。 Ki67（增殖細胞核抗原）是目前較為肯定的核增殖標志，開始表達于細胞周期的G1期，S期及G2期表達增加，M期達高峰，在分裂晚期很快消失，G0期無表達。Ki67半衰期短，脫離細胞周期后迅速降解。其表達量的變化可較客觀反映腫瘤的增殖活性。 國外最新研究表明，STK11基因等位缺失的PJS模型老鼠，胃

6、腸道錯構(gòu)瘤息肉間質(zhì)TGFβ信號缺陷，進而引起間質(zhì)鄰近的腺上皮細胞的增殖活躍，在野生型（無STK11缺失）老鼠胃腸粘膜則未發(fā)現(xiàn)此特點。研究者進而提出“STK11表達缺失→TGFβ信號調(diào)低→腺上皮過度增殖→促進PJ息肉形成”學說，認為人PJ息肉的形成與TGFβ信號的異常有密切關(guān)系。該學說為探索PJ息肉的形成機理提供了新的思路。 目的: 1.對PJS患者及家系STK11基因的胚系突變進行篩查，分析突變類型及可能的致病突變，探討

7、國人PJS家系STK11基因胚系突變的特點。 2.檢測STK11及TGFβ1蛋白在PJ息肉組織上的表達，結(jié)合對PJ息肉增殖活性的研究，從組織蛋白水平對“STK11缺失→TGFβ信號調(diào)低←腺上皮過度增殖→促進PJ息肉形成”學說進行初步驗證。材料與方法 1.PJS家系20例為實驗組（其中患者16例，家族正常人4例），隨機選擇與PJS家系無關(guān)的健康人20名做為對照組，兩組均抽取外周血5ml，提取基因組DNA。針對人類STK11

8、基因全部九個外顯子分別設計引物，PCR擴增后純化回收產(chǎn)物，DNA直接測序法檢測STK11基因胚系突變情況，NCBI在線BLAST比對初步篩查，陽性者分別與家系健康人及正常對照組比較，分析PJS家系STK11基因胚系突變特點。 2.PJ息肉石蠟標本23例（來自11名患者胃腸道不同部位息肉）為實驗組，正常胃腸粘膜組織10例為對照組。免疫組化SP法檢測STK11、TGFβ1及Ki67蛋白表達部位及陽性率，陽性率以染色標記指數(shù)（Labe

9、ling index，LI）表示。另外選取結(jié)腸腺瘤標本12例、結(jié)腸癌標本11例，同法檢測TGFβ1和Ki67蛋白表達部位及陽性率。 3.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。原始數(shù)據(jù)如滿足參數(shù)檢驗條件，兩獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗；多組獨立樣本均數(shù)比較采用方差分析（F檢驗）；雙變量相關(guān)性分析采用Pearson積差相關(guān)分析。如不滿足參數(shù)檢驗條件，兩獨立樣本差異比較采用Mannn-Whitney U檢驗；多組獨立樣本比較采用Kr

10、uskal-Wallis H檢驗；雙變量相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以雙側(cè)α=0.05作為檢驗水準。檢驗標準以P<0.05為有顯著性差異或有顯著相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果: 1.實驗組20例共有15例發(fā)現(xiàn)STK11基因外顯子序列的突變，形式均表現(xiàn)為點突變（錯義突變），預期效應是引起編碼蛋白異常。對照組未發(fā)現(xiàn)外顯子序列的堿基突變。突變分布于基因的第4號、6號及8號外顯子。發(fā)現(xiàn)家系A中，三名患者有第8外顯子354號密碼子

11、GAA→CAA雜合性突變，一名家系健康人無此突變，正常對照組未發(fā)現(xiàn)此突變。此外檢測到多名患者第4外顯子154、155、176及第6外顯子270位密碼子的錯義突變。 2.正常胃腸粘膜上皮及間質(zhì)細胞均表達STK11蛋白，為胞漿及胞核染色。PJ息肉STK11蛋白主要有三種表達類型：①上皮細胞表達降低、間質(zhì)細胞表達缺失；②完全表達缺失；③類似正常粘膜表達。正常胃腸粘膜上皮及間質(zhì)細胞表達TGFβ1蛋白，漿染為主，無核染。PJ息肉間質(zhì)細胞表

12、達為主，部分有上皮細胞染色，無核染。腺瘤及腺癌組織TGFβ1表達增強，胞漿、膜、核均著色，間質(zhì)表達增強。Ki67為特異性胞核染色，在PJ息肉、正常組織中表達低于腺瘤、腺癌組織。 3.經(jīng)Mann-Whitney u檢驗，PJS息肉STK11蛋白LI平均秩為13.5，正常組為25.05，u=34.500，P=0.002<0.05，二者有顯著性差異，PJ息肉較正常粘膜低表達STK11蛋白。PJS息肉TGFβ1蛋白LI平均秩為14.61

13、，正常組22.5，u=60.000，P=0.031<0.05，二者有顯著性差異，PJ息肉較正常粘膜低表達TGFβ1蛋白。采用Krus kal-Wallis H檢驗比較PJ息肉、正常胃腸組織、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸腺癌四組間Ki67的LI差異，四組平均秩依次為18.43、15.75、37，79、51.0。X2=39.711，P=0.000<0.05，四組間有顯著性差異，根據(jù)平均秩次，結(jié)腸癌組Ki67表達最高，其后依次是結(jié)腸腺瘤組、PJS組、正常組

14、。 4.Spearman秩相關(guān)分析PJ息肉標本STK11與TGFβ1的LI相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)rs=0.863，P=0.000<0.05，二者有顯著正相關(guān)關(guān)系。同樣做TGFβ1與Ki67的LI秩相關(guān)分析：rs=-0.422，P=0.045<0.05，二者呈顯著負相關(guān)關(guān)系。正常胃腸組織、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸腺癌TGFβ1、Ki67的LI相關(guān)性分析用Pearson積差相關(guān)進行分析，相關(guān)系數(shù)r依次為0.216、0.349、0.095，P值依次為

15、0.549、0.266、0.782，P值均大于0.05，無顯著相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論: 1.PJS家系存在多個STK11基因胚系突變位點，提示STK11基因胚系突變與PJS密切相關(guān)。STK11基因第8外顯子354密碼子GAA→CAA錯義突變與A家系PJS致病相關(guān)。第4外顯子154、155、176，第6外顯子270密碼子的錯義突變可能是相應PJS家系的致病突變。 2.PJ息肉表達STK11蛋白降低，提示該蛋白的功能對抑制