序貫注射太空鏈球菌對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞多糖分子表達(dá)影響的研究.pdf

1、1.背景 乙型鏈球菌制劑在臨床上的應(yīng)用也表明有明顯的抗瘤和提高免疫力作用。早在1967年日本學(xué)者Okamoto的研究證明：鏈球菌的抗腫瘤活性主要是由該菌產(chǎn)生的S溶血素所致，并證明溶血性鏈球菌對(duì)多種移植性動(dòng)物腫瘤均有殺傷作用，包括艾氏腹水癌、S180、S37、Bron-pearce癌、Krebs-2癌、Yoshida腹水肉瘤、纖維瘤、淋巴性白血?。⊿N36、L4946）、腹水性肝癌（AH-130、AH-66）[1]。與癌細(xì)胞接觸，

2、能直接破壞癌細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄過程，使癌細(xì)胞膨脹空泡化及崩潰壞死。此外還能啟動(dòng)細(xì)胞及體液免疫，使腫瘤壞死因子、干擾素、白介素等細(xì)胞因子水平顯著提高，從而包圍浸潤和附著在腫瘤細(xì)胞上，使之變性壞死，癌細(xì)胞減少，從而控制腫瘤生長。因此，溶血性鏈球菌制劑通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞和激活機(jī)體免疫系統(tǒng)非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，既是抗腫瘤藥物也可以免疫調(diào)節(jié)劑[2]。根據(jù)該原理研制并生產(chǎn)OK-432β-溶血性鏈球菌抗腫瘤生物制劑。該藥在日本已廣泛用于腫瘤的輔助治療，

3、是一種細(xì)菌免疫強(qiáng)誘導(dǎo)劑，溶血性鏈球菌高效低毒菌株SIPI722經(jīng)青霉素等處理后制成的凍干粉針劑。我國同類制劑（商品名：沙培林）也在腫瘤臨床廣泛使用， 近十多年來，我國載人航天科技發(fā)展迅猛，使得運(yùn)用載人航天飛船的空間技術(shù)條件進(jìn)行微生物太空誘變（Space Mutation）育種是培育生物新菌種成為現(xiàn)實(shí)。其原理是通過外層空間特殊的物理化學(xué)環(huán)境，即微重力、宇宙輻射、高能粒子、交變磁場(chǎng)及超潔凈等環(huán)境中，引起菌種DNA分子的變異和重組，菌

4、種遺傳性狀發(fā)生改變，從而獲得生命力旺盛、生長速度快、代謝產(chǎn)物獲得率高、品質(zhì)優(yōu)良并可穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)高效菌種。將溶血鏈球菌D33#連續(xù)多次搭載“神舟”系列飛船和返回式科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)衛(wèi)星，使之遨游太空實(shí)現(xiàn)了誘變，最終獲得高產(chǎn)高效、有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新型菌株溶血鏈球菌T33#。注射用多抗甲素（甘露聚糖肽）在我國臨床已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療療效顯著。該藥為溶血性鏈球菌33#菌株繹深層提煉而成的其免疫活性的a-甘露聚糖肽類物質(zhì)，對(duì)S180肉瘤有抑制

5、作用，抑小鼠艾氏腹水癌DNA合成，增加小鼠腹網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，促胸腺淋巴細(xì)胞代謝，拮抗CTX對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用。用免疫增強(qiáng)劑。具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和激活吞噬細(xì)胞、升高外周白細(xì)胞的作用；能提高骨髓造血機(jī)能和機(jī)體應(yīng)激能力。 眾所周知，生物細(xì)胞及血液中存在糖復(fù)合物。糖鏈?zhǔn)抢^蛋白質(zhì)、核酸之后的第三條生命鏈。復(fù)合物作為一類生物性物質(zhì)，廣泛存在于人體內(nèi)，愈來愈多的研究表明，糖復(fù)合物是體內(nèi)重要的信息分子，在細(xì)胞的分化

6、、信號(hào)的傳導(dǎo)、分子的識(shí)別等許多生命活動(dòng)中起著十分重要的作用。糖復(fù)合物中的寡鏈?zhǔn)欠肿娱g及細(xì)胞間識(shí)別的標(biāo)志。通過這種識(shí)別作用，許許多多的生物反應(yīng)被啟動(dòng)了。 在正常情況下，各種糖鏈表達(dá)的水平是相對(duì)穩(wěn)定的。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)惡變，糖鏈的性質(zhì)及數(shù)量都會(huì)發(fā)生一系列變化，并可以反映在于凝集素的結(jié)合能力上。凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。凝集素是一類

7、天然的免疫原性、能識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其與糖表現(xiàn)出專一性的結(jié)合，類似抗原抗體特異性結(jié)合。利用凝集素的這種天然特性，可將其作為探針檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)和血清中多糖水平。糖在目前的臨床診療當(dāng)中有著重要的作用。根據(jù)凝集素與糖的這個(gè)特異性結(jié)合，可以將其分為7大類：（1）D-甘露糖（D——葡萄糖）組；（2）N——乙酰葡萄糖胺組；（3）乙酰半乳糖胺組；（4）D——半乳糖組；（5）L——巖澡糖組；（6）唾液酸組；（7）復(fù)合糖組。各類凝集素相關(guān)多

8、糖分子和腫瘤的發(fā)病及診療均有較密切的關(guān)系。當(dāng)腫瘤出現(xiàn)時(shí)，糖復(fù)合物與凝集素結(jié)合會(huì)發(fā)生改變，而且腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測(cè)出來。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標(biāo)記、腫瘤特異性診斷的標(biāo)志、腫瘤惡性的標(biāo)記和不同腫瘤的分化標(biāo)記[13]。 2.目的 在不同種類的凝集素中選取五種有代表性的凝集素，分別是刀豆凝集素（ConA）、麥胚凝集素（WGA）、接骨木凝集素（SNA）、蓖麻凝

9、集素Ⅰ（RCAⅠ）、植物血凝（PHA）。利用凝集素與糖特異性結(jié)合的特性研究注射鏈球菌制劑對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞N-高甘露糖型、末端GlcNAc、末端Neu5Aca2-6Gal、末端Gaiβ1-4GlcNAc及Gal-NAC多糖分子表達(dá)變化的情況；觀察經(jīng)序貫注射后腫瘤生長情況；探討鏈球菌制劑抑瘤率與糖鏈表達(dá)水平的關(guān)系。 3.方法 3.1.建立動(dòng)物模型：隨機(jī)分成4組，①②③④每組10只。1）先將①②組小鼠進(jìn)行全身免疫，方

10、法：腹腔內(nèi)注射鏈球菌制劑（注射劑量均為0.1mg）。而③④組則腹腔內(nèi)注射生理鹽水；2）約一周后將4組小鼠均予皮下接種S180肉瘤細(xì)胞，約兩周后長出直徑約1cm的腫瘤；3）取出組①（腹腔注射鏈球菌制劑2組其中1組）以及組③（腹腔注射生理鹽水2組的其中1組），在瘤內(nèi)直接注射相同劑量的鏈球菌制劑，剩余2組②④注射生理鹽水。經(jīng)上述處理一周后，將小鼠處死取出腫瘤組織，分離出單個(gè)細(xì)胞懸液，用PBS緩沖溶液將其調(diào)整成相同濃度100毫克/ml，予超聲波

11、破碎腫瘤細(xì)胞，取其上清液。收集后于-70℃存放，待檢。 3.2.帶辣根過氧化物酶標(biāo)記的凝集素制備：通過改良過典酸鈉法將兩者偶聯(lián)[30]。檢查酶標(biāo)凝集素結(jié)合率及效價(jià)。 3.3.樣品收集及處理：S180肉瘤細(xì)胞樣品行超聲破碎，反復(fù)凍融后，在超聲破碎儀破碎。按超聲說明，將肉瘤細(xì)胞和PBS混合，并把濃度調(diào)整到每個(gè)樣品為100毫克/ml（通過顯微鏡檢，細(xì)胞數(shù)大約為7×108個(gè)/ml）功率：800W，總時(shí)間：4分鐘/樣品，破碎時(shí)間：

12、2分鐘（開5秒，關(guān)5秒）。根據(jù)公式：細(xì)胞相對(duì)破碎率=（1-超聲后細(xì)胞沉淀濕重/超聲前細(xì)胞沉淀濕重）%，計(jì)算出破碎率達(dá)98.7%。取上清液，離心20min（12000r/s），得澄清液在-20℃冰箱保存待測(cè)。 3.4.凝集素識(shí)別多糖分子的檢測(cè)：將樣品按以上的最適宜濃度包被96孔ELISA板上，每孔100μl，4℃過夜，PBS緩沖液洗1次，分別加入檢血清100μl，4℃反應(yīng)4h，PBS洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的糖蛋白，每孔10

13、0μl，4℃反應(yīng)4h，PBS洗3次，TMB2H2O2顯色10min，中止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)波長450nm OD的值。計(jì)算抑瘤率：[模型組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重]/模型組瘤重[28]。 3.5.實(shí)驗(yàn)對(duì)照：取破碎小鼠紅細(xì)胞的上清液代替待測(cè)樣品作陽性對(duì)照；用PBS代替檢測(cè)血清做陰性對(duì)照；其他步驟不變。 3.6.統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。 4.結(jié)果 4.1.計(jì)算抑瘤率計(jì)算聯(lián)合給藥治療組、全身給

14、藥治療組、局部給藥治療組的抑瘤率分別：35.1%、8.8%、19.9%。結(jié)果提示：聯(lián)合給藥組較全身給藥組及局部給藥組的抗瘤效應(yīng)顯著。 4.2.制備ConA-HRP/WAG-HRP/SNA-HRP/PHA-HRP/RCA1-HRP。標(biāo)記率分別為0.73、0.78、0.75、0.70、0.71。以ELISA法檢測(cè)效價(jià)均為1：1000。 4.3.各種小鼠腫瘤細(xì)胞ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1識(shí)別的相關(guān)多糖分子含量

15、OD值： 聯(lián)合給藥治療組樣品ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1識(shí)別的多糖分子含量OD值分另11：1.306±0.020、1.313±0.033、1.259±0.031、1.255±0.021、1.251±0.028 全身給藥組治療分別：1.856±0.025、1.737±0.033、1.444±0.028、1.669±0.035、1.566±0.035 局部給藥組治療分別：1.362±0.024、1.3

16、84±0.033、1.386±0.025、1.346±0.033、1.417±0.031 陰性對(duì)照組分別：1.952±0.024、1.764±0.032、1.534±0.025、1.802±0.034、1.689±0.030 以上結(jié)果輸入SPSS13.0作析因分析，（腹腔內(nèi)注射及瘤內(nèi)注射）主效應(yīng)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異A腹腔注射鏈球菌P=0.000；B瘤內(nèi)注射鏈球菌P=0.000，可以認(rèn)為腹腔內(nèi)注射鏈球菌及瘤內(nèi)注射鏈球菌均能使

17、ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相關(guān)多糖分子表達(dá)含量降低；五種相關(guān)多糖兩因素有交互作用，腹腔內(nèi)及瘤內(nèi)均注射（序貫給藥）太空鏈球菌時(shí)，ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相關(guān)多糖分子表達(dá)含量降低最顯著。 5.結(jié)論 5.1.先全身給藥后局部給藥的序貫給藥治療方法對(duì)小鼠S180肉瘤的生長的影響經(jīng)析因分析兩因素有交互效應(yīng)，腹腔內(nèi)注射免疫小鼠對(duì)瘤內(nèi)注射有增效作用，表明S180荷瘤小鼠的序貫免疫注射太空鏈球菌制劑