VHL---腎細胞癌腫瘤形成過程中HIF2α靶基因作用研究.pdf

1、研究目的:
　　約70％的腎透明細胞癌存在VHL等位基因的失活、表達缺失（表現(xiàn)為基因突變、缺失及啟動子甲基化等），表明VHL基因突變(VHL-/-)在腎細胞癌的形成過程中具有重要的作用。VHL基因蛋白產物(pVHL)可與HIF結合，使HIF泛素化被蛋白水解酶降解。VHL-/-腎細胞癌細胞系786-O由于VHL的表達缺失而導致細胞內HIF-2α大量累積，后者可進一步誘導百余種缺氧適應基因(HIF-2α下游靶基因)的表達。本研究的目的

2、在于探討VHL-/-腎細胞癌腫瘤形成過程中HIF-2α下游靶基因的作用，尋找潛在的治療靶點，為腎細胞癌診斷、治療及預后提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.應用半定量QPCR技術在mRNA水平驗證在786-O細胞(786-O VHL+/+，786-O VHL-/-,786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF566],786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF1631], VHL+/+ H

3、IF2α-dPA[active], VHL+/+ HIF2α-PA-dTA[inactive])由單一的有活性的HIF-2α誘導表達升高的基因;
　　2.應用RNAi技術，慢病毒介導shRNA沉默特定HIF下游靶基因;
　　3.對穩(wěn)定轉染相應shRNA的細胞進行Western Blot，Real Time RCR或者Elisa驗證其是否成功抑制該基因的表達;
　　4.體外增殖實驗及裸鼠體內成瘤實驗，研究特定HIF2α下

4、游靶基因對VHL-/-腎細胞癌腫瘤形成的作用。
　　結果:
　　1.體內及體外實驗證實HIF對VHL-/-的腎細胞癌成瘤十分重要。
　　2.在786-O細胞中，HIF轉錄活性緊密調控著VEGF，CCND1，ENO2，EglN3，ANGPTL4, Glut-1, IGFBP3, HIG2, CA12, MTUS1, ZNF395, CP, MXI-1,ARRDC3，Serpine1，Apol1，DDIT4，DUSP1等基

5、因的表達。
　　3.抑制VEGF，CCND1的表達可以抑制VHL-/-腎細胞癌生長，提示它們是促癌基因;抑制ANGPTL4，EGLN3或ENO2的表達并不影響VHL-/-腎細胞癌生長;GLUT1或IGFBP3表達缺失明顯促進VHL-/-腎細胞癌生長，提示它們有一定的抑瘤作用。
　　4.抑制IGF1R蛋白表達導致IGFBP3在mRNA和蛋白水平表達的顯著增加，并抑制腫瘤生長，提示IGF1R是潛在的腎細胞癌治療靶點。
　　

6、結論:
　　1.HIF-2α對VHL-/-腎細胞癌成瘤至關重要，但HIF下游靶基因的表達對腎癌細胞生長的作用則可表現(xiàn)為促進、抑制亦或沒有影響;通過對HIF-2α下游靶基因的研究可以發(fā)現(xiàn)潛在的VHL-/-腎細胞癌治療靶點或診斷及預后指標。
　　2.沉默IGF1R能夠抑制腎細胞癌細胞系786-O成瘤，提示IGF1R是潛在的腎細胞癌治療靶點，其作用的發(fā)揮可能通過上調IGFBP-3而實現(xiàn)，為進一步明確VHL-HIF-HRGs調節(jié)腫瘤