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文檔簡介
1、尿石癥是泌尿外科的最常見的疾病之一,而男性結石的發(fā)病率遠遠高于女性,以前對結石發(fā)病機制的研究多集中在動物模型中雄激素對尿液成分的影響與結石形成的關系,即尿液中草酸等促進結石成分的過飽和以及骨橋蛋白,枸櫞酸等抑制結石形成的成分的減少,而近年發(fā)現(xiàn)僅有尿液中結石成分過飽和、抑制結石成分的下降是很難形成腎結石的,腎小管上皮細胞在腎結石產(chǎn)生的過程中發(fā)揮了十分重要的作用,事實上,只有結晶粘附于腎小管上皮細胞上才能繼續(xù)生長,變成有臨床癥狀的結石。但是
2、雄激素在腎結石患者腎小管上皮細胞的作用方面,目前極少有研究涉及,而這方面的研究,能更好的闡釋腎結石發(fā)病的性別差異的問題,能為腎結石的發(fā)病機制的研究提供新的研究思路和方向。
目的:
1、探討雄激素是否為腎結石的誘發(fā)因素之一,即雄激素是否促進了腎結石的產(chǎn)程。
2、探討雄激素促進腎結石產(chǎn)生的機制,即雄激素對腎小管上皮細胞的作用及其作用機制。
內容:
1、選取接受經(jīng)皮腎鏡檢查
3、碎石手術(PCNL術)的成年男性患者,和體檢合格的正常男性患者,留取患者血漿標本采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測患者睪酮和游離睪酮水平;并于手術結束時超聲引導下穿刺獲得腎小管上皮組織;術后留取患者結石成分,采用傅立葉轉換紅外光譜測定結石成分。然后采用正常腎組織作為對照,采用免疫組化方法檢測結石患者腎小管上皮組織的雄激素受體表達情況以及叢生蛋白的表達情況,比較二者表達與各自對照組有無差別。
2、培養(yǎng)HK-2細胞,然后在培養(yǎng)基
4、中加入不同終濃度的睪酮(1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)以及雄激素拮抗劑氟他胺(100 nM),分別作用6小時,24小時和72小時,然后采用MTT法檢測睪酮對HK-2細胞的生長抑制情況,再采用流式細胞技術檢測細胞的凋亡情況。
3、檢測上述條件下睪酮及雄激素受體拮抗劑處理過的HK-2細胞的凋亡相關蛋白叢生蛋白的表達情況并比較其兩種亞型分泌型(s-clusterin)和細胞核型(n-clusterin)表達
5、的差別,采用RT-PCR方法和Western-blotting方法檢測上述二者在mRNA水平和蛋白水平表達的差異,了解他們在睪酮誘導的腎小管上皮細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。
結果:
1、所有男性結石患者術后結石紅外光譜測定結石成分,均以草酸鈣成分為主,包括一水草酸鈣和二水草酸鈣。所有入選對象ELISA法檢測血睪酮和游離睪酮結果表明,腎結石患者的血睪酮和游離睪酮水平均高于正常對照人群(P<0.01),而且血睪酮
6、和游離睪酮二者具有明顯的正相關關系(P<0.05)。免疫組化研究結果表明,腎小管上皮細胞的細胞核雄激素受體表達陽性,近曲小管、遠曲小管、集合管均有表達,以近曲小管、遠曲小管為主,而且結石患者腎組織表達強度明顯高于正常對照組(P<0.05);同樣,免疫組化結果表明,在腎小管上皮細胞的細胞漿中叢生蛋白表達陽性,結石患者的表達水平高于正常對照組(P<0.05)。
2、體外HK-2細胞學實驗表明,睪酮能抑制細胞增殖,MTT法檢測細
7、胞生長抑制曲線,表明隨著睪酮濃度的增高,作用時間的延長,睪酮對細胞生長的抑制明顯升高(P<0.01),最大的抑制率為1000nM,作用72小時;其次睪酮能誘導細胞發(fā)生凋亡,流式細胞儀檢測表明,經(jīng)過睪酮處理的HK-2細胞的凋亡百分率明顯高于對照組細胞,而且同樣隨著睪酮濃度的升高、處理時間的延長,凋亡率明顯升高,并且具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3、檢測經(jīng)睪酮處理過的HK-2細胞叢生蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)睪酮處理過以后,采
8、用RT-PCR方法檢測mRNA表達、采用western-blotting法檢測蛋白水平的表達,結果發(fā)現(xiàn)s-clusterin蛋白表達下降,而n-clusterin蛋白表達升高,二者共同作用參與了HK-2細胞的凋亡過程。
結論:
1、男性腎結石患者的血總睪酮水平、游離睪酮水平均明顯高于正常對照組,腎結石腎組織的雄激素受體表達明顯高于正常對照,所以推測雄激素在腎臟草酸鈣結石產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用,在全身循環(huán)代
9、謝和腎臟腎小管上皮細胞都產(chǎn)生影響,促進了腎結石的產(chǎn)生。
2、睪酮能夠抑制腎小管上皮細胞增殖,誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡,并且具有劑量和時間依賴效應,因此這種對腎小管上皮細胞的作用很可能是其參與腎結石形成的途徑之一。
3、經(jīng)睪酮處理后腎小管上皮細胞,RT-PCR結果表明clusterin的mRNA水平升高,western-blotting方法檢測結果表明N-clusterin的蛋白水平升高,而S-cluster
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