OX1R和KOR異源二聚化對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的影響.pdf

1、食欲素（Orexin，OX）/食欲素受體（Orexin receptor，OXR）系統(tǒng)和強啡肽/κ型阿片肽受體系統(tǒng)在獎賞通路的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥的發(fā)病機制和病理生理過程密切相關(guān)。食欲素1型受體(OX1R)和κ型阿片肽受體（KOR）都是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族A類亞家族的成員。關(guān)于二者異源二聚化的研究，到目前為止尚未見報道。本實驗主要觀察OX1R和KOR能否形成異源二聚體以及二聚體形成后對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的影響，

2、為進一步分析OX1R和KOR參與的包括抑郁癥在內(nèi)的多種疾病的作用機制提供實驗依據(jù)并為相關(guān)疾病的治療提供新的作用靶點。
　　首先利用分子克隆的方法成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒EGFP-OX1R。利用激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-OX1R瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞后的表達。然后進行免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時共轉(zhuǎn)染OX1R-EGFP和KOR-Myc的HEK293細胞，OX1R和KOR在細胞膜的共定位表達。利用生物共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

3、（bioluminesence resonance energy transfer，BRET）檢測OX1R和KOR的異源二聚化。最后建立單獨或共表達OX1R和KOR的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，通過雙熒光素酶法檢測在OrexinA或DynA(1-13)處理下HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)的報告基因血清反應元件（SRE）、cAMP反應元件（CRE）、激活T細胞的細胞核因子（NFAT）的表達。Wester

4、n blot法檢測在OrexinA或DynA(1-13)刺激下cAMP反應元件鏈接蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)的磷酸化活性變化。OrexinA或DynA(1-13)處理 HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞后，檢測細胞內(nèi)cAMP的變化。Fluo-4

5、NW試劑盒檢測OrexinA或DynA(1-13)誘導HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量的變化。通過對CRE、SRE、NFAT、cAMP和Ca2+在細胞內(nèi)含量的變化以及對細胞內(nèi)CREB磷酸化活性的檢測探究OX1R和KOR發(fā)生異源二聚化后對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的影響。
　　結(jié)果顯示，EGFP-OX1R重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并且能夠在細胞膜上正確表達；在激光共聚焦顯微鏡下觀察到O

6、X1R和KOR能夠同時在細胞膜上表達，表明二者存在發(fā)生相互作用的空間基礎(chǔ)；BRET實驗證明OX1R和KOR能夠形成組成型的二聚體，并證明在orexin A和DynA(1-13)的作用下OX1R和KOR之間的親和力增強，OX1R和KOR形成二聚體的能力增加，引起B(yǎng)RET信號的增強；在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染CRE-luc、SRE-luc或NFAT-luc，48小時

7、后在相應激動劑的作用下檢測CRE、SRE或NFAT的表達，結(jié)果顯示，與OX1R或KOR單轉(zhuǎn)細胞相比，OX1R和KOR共轉(zhuǎn)細胞內(nèi)CRE的表達增加，而SRE和NFAT的表達降低，說明OX1R和KOR形成二聚體后與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結(jié)合減少而與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加；Western blot檢測濃度和時間依賴性CREB磷酸化活性實驗結(jié)果表明，與OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-

8、KOR細胞相比，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，從2.5min到40min，CREB磷酸化均增強，且HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性在2.5min時達到峰值；濃度依賴的CREB磷酸化檢測結(jié)果表明，從10Nm~100nM，OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性要比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細

9、胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR細胞內(nèi)的磷酸化活性明顯增加，表明OX1R/KOR二聚化后與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加，增強了細胞內(nèi)CREB的磷酸化；細胞內(nèi)鈣離子含量的檢測結(jié)果表明，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，細胞內(nèi)的鈣離子含量比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞內(nèi)的含量降低，進一步表明OX1R/KOR二聚體與Gαq亞型的G蛋白結(jié)合降低；同理，在對細胞內(nèi)c

10、AMP含量的檢測實驗中我們看到OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)cAMP的含量也明顯比DynA(1-13)處理的HEK293-KOR細胞內(nèi)的含量增加，表明OX1R/KOR二聚體與Gαi亞型的G蛋白結(jié)合降低，與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染OX1R和KOR的HEK293細胞內(nèi)，OX1R和KOR能夠形成穩(wěn)定的異源二聚體，在食欲素或強啡肽作用下OX1R/KOR二聚體改變了原

11、有單體的信號轉(zhuǎn)導通路，使OX1R/KOR二聚體與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結(jié)合減少而與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路向AC/PKA發(fā)生偏轉(zhuǎn)，使細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性增加。CRE B的活性與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，在抑郁癥的發(fā)病機制和治療的研究中占有重要地位。因此，對OX1R和KOR異源二聚化的研究為深入研究OX1R和KOR與抑郁癥的關(guān)系提供了新的實驗依據(jù)，為臨床上抑郁癥的治療提供了新的思路，為抗抑郁新藥的研發(fā)提供了新的