細(xì)胞內(nèi)ROS水平改變對細(xì)胞活性及相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、許多器官損害及腫瘤疾病與氧化壓力引起的細(xì)胞損傷、致癌作用有著密切的聯(lián)系。細(xì)胞內(nèi)的活性氧(Reactive oxidative species，ROS)作為新陳代謝的產(chǎn)物在各類細(xì)胞中不斷產(chǎn)生和清除，而且在不同的細(xì)胞中ROS的表達(dá)水平是不相同的，更為重要的是相對于腫瘤細(xì)胞，在其相對應(yīng)的正常細(xì)胞中本底的ROS水平明顯更低。ROS在多種生理和病理過程中扮演著重要的角色，并在許多信號途徑中作為第二信使，比如AKT途徑、線粒體介導(dǎo)的casepase

2、凋亡途徑、細(xì)胞周期蛋白調(diào)控抑制細(xì)胞增殖途徑等等。ROS這種復(fù)雜的角色使其在生物代謝過程中必須受到嚴(yán)格的控制，任何細(xì)胞內(nèi)ROS水平的改變，則很可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部活性的變化，然而涉及到的細(xì)胞內(nèi)完整的信號途徑仍然是不清楚的。本論文通過分別構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)高ROS環(huán)境或低ROS環(huán)境，研究其對細(xì)胞活性的影響，并探索較完善的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑，為闡明ROS在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的角色提供實驗基礎(chǔ)，并為研究與ROS相關(guān)的藥物的作用機理提供理論支持。
　　 本研究的主

3、要結(jié)論如下：
　　 1.描述三種檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2的探針的性質(zhì)和生物學(xué)應(yīng)用。通過共聚焦熒光顯微鏡分析等方法比較三種探針的靈敏性、細(xì)胞內(nèi)分布、細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度的動力學(xué)檢測，我們得到：DHR123能夠高效、準(zhǔn)確追蹤細(xì)胞內(nèi)的H2O2，因此DHR123是最適合的檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2分布、濃度、H2O2介導(dǎo)反應(yīng)等的探針。
　　 2.選用三種腫瘤細(xì)胞株作為實驗對象，H2O2和NAC都呈現(xiàn)出很好的抑制腫瘤細(xì)胞活性的現(xiàn)象，并具有作用濃度

4、與作用時間的依賴性，其中SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞對H2O2更加敏感，HepG2人肝癌細(xì)胞則對NAC更加敏感。而氧化還原狀態(tài)的檢測則表明，H2O2有效地提高了三種腫瘤細(xì)胞的氧化壓力，而NAC則展現(xiàn)出相反的結(jié)果，這也再次證實，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變都有可能影響細(xì)胞的活性。值得注意的是：H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變在SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞中更加明顯，而NAC誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變則在HepG2人肝癌細(xì)胞中更加顯著，這與細(xì)

5、胞活性檢測的結(jié)果相吻合，這也暗示出ROS水平的改變對細(xì)胞命運的密切影響。
　　 3.進一步研究了H2O2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞活性降低的機理，從而闡明高氧化壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。結(jié)果表明：增加的氧化壓力誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)Ca2+的升高，導(dǎo)致線粒體Ca2+的超載，進一步誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的擴增，而高濃度的ROS通過刺激細(xì)胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的釋放，損害Ca2+清除系統(tǒng)，從而便于Ca2+的積累；而凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表達(dá)水平的變化，導(dǎo)致細(xì)胞色素c

6、從線粒體釋放，激活相關(guān)casepase的活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 4.研究兩種在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性的物質(zhì)(Tα1、FLZ)的作用機理，其共同的特點是能夠降低細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力水平。Tα1能夠有效地降低HepG2人肝癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并提高細(xì)胞內(nèi)的GSH水平，抑制細(xì)胞處于G1期，從而降低細(xì)胞活性，然而在小鼠脾淋巴細(xì)胞中表現(xiàn)出正好相反的結(jié)果。FLZ能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的活性，但對正常肝細(xì)胞的毒性很小，這可能與正常細(xì)

7、胞內(nèi)低本底ROS水平有關(guān)。進一步的研究表明：FLZ的抗腫瘤活性是通過周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)或者激活實現(xiàn)的，而這與細(xì)胞內(nèi)降低的Ca2+/ROS水平有關(guān)。總之，如果一個物質(zhì)能夠有效地降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，其理論上具有一定的抗腫瘤活性，但其是否能作為一種潛在的治療手段是需要更深入研究的。
　　 5.探索了在高氧化壓力誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中ASPP家族蛋白的角色，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)iASPP蛋白，能夠有效抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，揭示A