炎癥相關(guān)因子TLR4及其下游STAT3信號(hào)通路干預(yù)在多發(fā)性骨髓瘤中的作用及意義研究.pdf

1、目的：
　　 多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一種起源于B細(xì)胞系并能夠產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的惡性血液系統(tǒng)疾病。MM患者往往對(duì)常規(guī)化療產(chǎn)生抗藥性,這是目前MM治療的主要挑戰(zhàn)之一。目前的研究認(rèn)為MM患者對(duì)細(xì)菌、真菌及病毒極其易感,認(rèn)為反復(fù)不愈的感染可能是MM發(fā)病及進(jìn)展的原因之一,被炎性因子LPS(模仿細(xì)菌感染)活化的TLR4信號(hào)有利于骨髓瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的微環(huán)境,保護(hù)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡,這項(xiàng)報(bào)道為MM的研究提

2、出了一個(gè)新的視點(diǎn),首次提出炎癥與MM發(fā)生發(fā)展的可能聯(lián)系。而LPS也能通過產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥,促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要介質(zhì)IL-1β和IL-6而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3。IL-6是MM發(fā)生和進(jìn)展最重要的細(xì)胞因子,IL-6可通過與其受體sIL-6R結(jié)合,通過激活JAK(Janus killase)通路,并進(jìn)一步激活其下游的STAT3通路,影響各種抑制凋亡,促使增殖,促使血管新生,以及免疫調(diào)節(jié)基因等從而促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促使

3、腫瘤轉(zhuǎn)移或免疫逃逸最終促使腫瘤發(fā)生和發(fā)展。而且有研究表明刺激TLR4和TLR9可以直接激活STAT3。這些研究為TLR4作為感染的觸發(fā)因子,為何可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)提供了潛在機(jī)制。同時(shí)有研究報(bào)道MM骨髓微環(huán)境是缺氧的,缺氧的骨髓微環(huán)境可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在MM細(xì)胞表達(dá),并發(fā)現(xiàn)HIF-1α促使MM細(xì)胞VEGF表達(dá),誘導(dǎo)血管新生,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。因此TLR4,STAT3和HIF-1α信號(hào)有可能成為腫瘤治療的靶向,研究干預(yù)這些信號(hào)對(duì)骨

4、髓瘤生長(zhǎng)的影響將為骨髓瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR檢測(cè)各骨髓瘤細(xì)胞株MM.1S、MM.1R、U266和ARP-1細(xì)胞TLRs mRNA表達(dá)及原代CD138+骨髓瘤細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá),采用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá),real-time PCR及流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)了骨髓瘤細(xì)胞表面免疫調(diào)節(jié)分子B7一H1、B7-H2、CD40、VEGF和TGF-β的表達(dá)及LPS對(duì)這些表面免

5、疫調(diào)節(jié)因子的影響。
　　 2.H3及流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4受體活化前后細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期變化和T細(xì)胞增殖影響。
　　 3.Western blot檢測(cè)TLR4受體活化前后MAPK信號(hào)家族因子ERK、JNK和p38磷酸化及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè)。
　　 4.ELISA方法進(jìn)一步檢測(cè)了免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-18、IL-6和IL-12在TLR4介導(dǎo)的MM細(xì)胞免疫逃逸中的作用。
　　 5.MSD(

6、Meso Scale Discovery)和western blot檢測(cè)系列細(xì)胞因子刺激骨髓瘤細(xì)胞后p-STAT3,STAT3,p-STAT5,STAT5的表達(dá)和缺氧誘導(dǎo)后骨髓瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α和HIF1β的表達(dá)。
　　 6.MSD和westernblot檢測(cè)WP1066對(duì)MM細(xì)胞STAT3,STAT5激活和表達(dá)以及HIF1α和HIF1β表達(dá)的影響。
　　 7.MTS檢測(cè)WP1066對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

7、
　　 8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)WP1066對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用以及westernblot及MSD檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR結(jié)果表明骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)TLRs mRNA,包括TLR1-2,4-7和9,本課題重點(diǎn)研究TLR4,細(xì)胞株株MM.1S、MM.1R和ARP-1細(xì)胞表達(dá)TLR4,而U266細(xì)胞表達(dá)不明顯,同時(shí),用PE染色的TLR4流式抗體檢測(cè)了各細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況,根據(jù)T

8、LR4峰的右移程度來判斷表達(dá)的高低,TLR4峰右移越明顯,則表明蛋白表達(dá)越高。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MM.1S、MM.1R和ARP-1細(xì)胞明顯表達(dá)TLR4,而U266細(xì)胞表達(dá)不明顯。這個(gè)流式結(jié)果從蛋白角度表明TLR4表達(dá)在細(xì)胞表面,而且我們還證實(shí)TLR4蛋白同時(shí)在原代骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)。
　　 2.TLR4的配體LPS(0、1、2、4μg／ml)刺激MM細(xì)胞后48h后,TLR4陽性表達(dá)的MM細(xì)胞株MM.1S、MM.1R和ARP-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖

9、,而TLR4表達(dá)陰性的MM細(xì)胞株U266增殖不明顯。我們先用LPS(2μg／ml)刺激4 h,再加入阿霉素0.4μg／ml刺激24 h,最后AnnexinV／P I雙染色流式檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MM.1S和ARP-1對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡有明顯的抵抗作用,MM.1S細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后,阿霉素誘導(dǎo)的凋亡率從(79.01±15)％降至(38.73±8.5)％(P<0.01),而U266細(xì)胞LPS刺激后凋亡率無明顯降低f(42.35±7.3)％VS(4

10、3.18±6.8)％,P>0.05],LPS不能保護(hù)阿霉素對(duì)U266的誘導(dǎo)凋亡作用。而且LPS誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變,LPS(2μg／ml)處理細(xì)胞12、24和48小時(shí)后,細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞明顯減少,S期細(xì)胞明顯增多。
　　 3.TLR4的配體LPS誘導(dǎo)MM細(xì)胞株MM.1S和ARP-1細(xì)胞MAPK信號(hào)家族因子ERIC、JNK和p38磷酸化,并增加核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白表達(dá)增加,呈時(shí)間依賴,我們使用LPS作用細(xì)胞20、60和180m

11、in,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS作用細(xì)胞20min即出現(xiàn)ERK和JNK磷酸化,而p38磷酸化在LPS作用細(xì)胞60min后明顯,而且我們使用ERK1／2抑制劑U0126(25μM),JNK抑制劑SP600125(50μM)和p38抑制劑SB20358(50μM)作用MM.1S細(xì)胞1小時(shí)后,LPS作用細(xì)胞48小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖,我們發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)細(xì)胞增殖作用依賴MAPK信號(hào)通路。
　　 4.使用real-time PCR方法檢測(cè)了LPS對(duì)MM細(xì)胞

12、株MM.1S細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)分子B7-H1、B7-H2、CD40、VEGF和TGF-β的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS明顯增加B7-H1和B7-H2的表達(dá),少量增加CD40表達(dá),TLR4活化的骨髓瘤細(xì)胞抑制健康供者外周血T細(xì)胞增殖。
　　 5.TLR4的配體LPS(2μg／ml)作用MM細(xì)胞株MM.1R、MM.1S、ARP-1和U266細(xì)胞48小時(shí),ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清IL-6、IL-12和IL-18分泌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)MM.1R、MM

13、.1S和ARP-1細(xì)胞IL-18分泌,促進(jìn)ARP-1細(xì)胞IL-6分泌,而對(duì)IL-12分泌無明顯影響。而且我們進(jìn)一步證實(shí)LPS對(duì)IL-18分泌的影響通過TLR4和MAPK途徑。
　　 6.研究發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤細(xì)胞株MM.1S、ARP-1和U266細(xì)胞,U266細(xì)胞STAT3持續(xù)激活,而MM.1S和ARP.1在自然情況下無STAT3激活。我們選擇MM.1S和ARP-1細(xì)胞株,應(yīng)用一整套細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,包括EGF50ng／ml、bFG

14、F20ng／ml、G-CSF20ng／ml、Erythropoirtin10 IU／ml,IFNα-2a50000IU／ml,IFNβ20ng／ml,IFNγ20ng／ml,IL-220ng／ml、IL-420ng／ml、IL-650ng／ml、IL-720ng／ml、IL-820ng／ml、IL-1050ng／ml、IL-1220ng／ml、IL-1520ng／ml、IL-1620ng／ml、IL-2020ng／ml和IL-2220n

15、g／ml分別在細(xì)胞血清饑餓狀態(tài)刺激30分鐘,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-6、IFNα和IFNβ促使骨髓瘤細(xì)胞STAT3和STAT5磷酸化,而且我們還比較了血清饑餓狀態(tài)和10％血清濃度下細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在血清饑餓或血清培養(yǎng)狀態(tài),細(xì)胞因子IL-6、IFNα和IFNβ都能刺激STAT3和STAT5磷酸化。
　　 7.我們檢測(cè)了新穎的JAK／STAT3抑制劑WP1066對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株MM-1S、ARP-1和U266的增殖抑制

16、作用。使用WP1066濃度0.5—10μM,作用細(xì)胞24、48和72小時(shí),MTS檢測(cè)增殖抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株ARP-1的IC50是24小時(shí)為3.25μM,48小時(shí)為2.74μM,72小時(shí)為1.67μM,細(xì)胞株MM.1S的IC50是24小時(shí)為3.77μM,48小時(shí)為3.20μM,72小時(shí)為2.32μM,細(xì)胞株U266的IC50是24小時(shí)為8.81μM,48小時(shí)為4.61μM,72小時(shí)為2.15μM。同時(shí)我們也檢測(cè)了WP1066對(duì)骨髓瘤

17、原代CD138+細(xì)胞的增殖抑制作用,CD138-細(xì)胞作為對(duì)照,WP1066對(duì)骨髓瘤原代CD138+細(xì)胞有明顯增殖抑制作用,24小時(shí)IC50為5.674μM,而CD138-細(xì)胞的24小時(shí)IC50大于10μM。
　　 8.JAK／STAT3抑制劑WP1066誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,凋亡相關(guān)基因caspase3和PARP裂解。我們使用WP10661、2和5μ作用骨髓瘤細(xì)胞株MM.1S、ARP-1和U266細(xì)胞24小時(shí),AnnexinV／P

18、I檢測(cè)細(xì)胞凋亡,并使用MSD和western blot檢測(cè)裂解的caspase3和PARP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WP1066誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呈濃度依賴,而且在細(xì)胞凋亡過程中,凋亡相關(guān)基因caspase3和PARP發(fā)生裂解。JAK／STAT3抑制劑AG490、CABE和WP1066抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化,呈濃度和時(shí)間依賴。我們使用AG490濃度50、100和300μM,CABE濃度50和100μM和WP1066濃度2.5、5和10μM作用MM

19、細(xì)胞株MM.1S和ARP-1細(xì)胞5小時(shí),IL-6作用細(xì)胞30分鐘,MSD和western blot檢測(cè)磷酸化的STAT3蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG490、CABE和WP1066抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化,呈濃度依賴,其明顯作用濃度分別AG490為300μM,CABE為100μM和WP10665-10μM,而且我們還研究了藥物作用的時(shí)間梯度,我們分別使用300μMAG490,100μM CA.BE和5μM WP1066作用細(xì)胞1、4和6小

20、時(shí),檢測(cè)磷酸化的STAT3蛋白,我們發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)STAT3蛋白磷酸化的抑制作用同樣呈時(shí)間依賴,最大作用時(shí)間為6小時(shí)。
　　 10.JAK／STAT3抑制劑AG490,CABE和WP1066抑制IFNα誘導(dǎo)的STAT3磷酸化。我們使用AG490和CABE濃度50、100和300μM,WP1066濃度2.5、5和10μM作用MM細(xì)胞株ARP-1和U266細(xì)胞5小時(shí),IFNα作用30分鐘,結(jié)果顯示AG490、CABE和WP1066抑制A

21、RP-1和U266細(xì)胞IFNα誘導(dǎo)的STAT3磷酸化,對(duì)ARP-1的抑制作用優(yōu)于U266。
　　 11.JAK／STAT3抑制劑WP1066下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的可溶性蛋白裂解液HIF-1α和HIF-1β表達(dá),而這些蛋白在蛋白裂解液高速離心后留下的不可溶沉淀有升高趨勢(shì)。我們的MSD研究顯示骨髓瘤細(xì)胞株MM.1S、ARP-1和U266細(xì)胞在正常氧濃度下僅有低表達(dá)HIF-1α,而HIF-1β持續(xù)表達(dá)。我們放置細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱(氧濃度1％,二

22、氧化碳濃度5％)4、8、16和24小時(shí)后MSD檢測(cè)HIF-1α表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)在8小時(shí)表達(dá)最高,而后逐漸下降。因此我們使用WP1066濃度2.5、5和10μM在缺氧培養(yǎng)箱作用8小時(shí)檢測(cè)HIF-1α和HIF-1β、我們發(fā)現(xiàn)WP1066下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的可溶性蛋白裂解液HIF-1α和HIF-1β表達(dá),而這些蛋白在蛋白裂解液高速離心后留下的不可溶沉淀有升高趨勢(shì)。
　　 12.JAK／STAT3抑制劑WP1066下調(diào)可溶性蛋白

23、裂解液STAT3和STAT5表達(dá),STAT3和STAT5表達(dá)在蛋白裂解液高速離心后留下的不可溶沉淀中升高。我們使用WP1066濃度2.5、5和10μM作用MM細(xì)胞株MM.1S、ARP-1和U266細(xì)胞24小時(shí),IL-6作用30分鐘,分別檢測(cè)可溶性蛋白裂解液和不可溶沉淀中pSTAT3和STAT3表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)WP1066抑制pSTAT3表達(dá),可溶性裂解液和不可溶沉淀獲得一致結(jié)果,而WP1066抑制可溶性蛋白裂解液STAT3表達(dá),而同時(shí)ST

24、AT3在不可溶沉淀中表達(dá)增高。因此我們繼續(xù)檢測(cè)了時(shí)間梯度,我們選擇WP1066濃度5μM作用ARP-1和U266細(xì)胞4、8、12和24小時(shí),檢測(cè)STAT3、STAT5和JAK2表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在藥物作用12小時(shí)后STAT3和STAT5下調(diào),而JAK2下調(diào)略弱于STAT3和STAT5。
　　 小結(jié)：
　　 1.骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)TLRs mRNA,MM.1S、MM.1R和ARP-1細(xì)胞明顯表達(dá)TLR4,而U266細(xì)胞表達(dá)不明顯。

25、TLR4表達(dá)在細(xì)胞表面,而且在原代骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)。
　　 2.LPS促使TLR4陽性表達(dá)的MM細(xì)胞株細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖,保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞明顯減少,S期細(xì)胞明顯增多。
　　 3.LPS促進(jìn)細(xì)胞增殖和IL-18作用依賴MAPK信號(hào)通路。LPS明顯增加B7-H1和B7-H2的表達(dá),少量增加CD40表達(dá),TLR4活化的骨髓瘤細(xì)胞抑制健康供者外周血T細(xì)胞增殖。
　　 4.無論在血清饑餓或血清培養(yǎng)

26、狀態(tài),細(xì)胞因子IL-6、IFNα和IFNβ都能刺激STAT3和STAT5磷酸化。
　　 5.JAK／STAT3抑制劑WP1066對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株MM.1S、ARP-1和U266和原代CD138+細(xì)胞均有增殖抑制作用。WP1066誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呈濃度依賴,而且在細(xì)胞凋亡過程中,凋亡相關(guān)基因caspase3和PARP發(fā)生裂解。
　　 6.JAK／STAT3抑制劑AG490、CABE和WP1066抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化