Dickkopf1在多發(fā)性骨髓瘤中的作用.pdf

1、第一部分DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床研究 目的：研究MM患者骨髓上清液及血清Dickkopf1(DKK1)水平，及其與骨髓瘤分期、溶骨性病變的關(guān)系，以及不同化療方案對(duì)DKK1的影響及與療效的關(guān)系，探討DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床作用。 方法：采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)80例初診MM患者、10例MGUS患者及20例對(duì)照骨髓上清液及血清DKK1水平，以及檢測(cè)136例接受硼替佐米+地塞米松或沙利度胺+地

2、塞米松治療的MM患者化療前后血清DKK1水平。 結(jié)論：MM患者DKK1水平明顯高于MGUS患者及對(duì)照組，而且DKK1水平與骨髓瘤分期及溶骨性病變密切相關(guān)，能反映溶骨性病變的程度和范圍。DKK1水平在化療有效時(shí)明顯下降，但與化療方案有關(guān)，硼替佐米能使DKK1水平明顯下降，而沙利度胺及地塞米松卻無(wú)此作用。 第二部分骨髓瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞DKK1相關(guān)受體LRP5/6及Kremen1/2基因轉(zhuǎn)錄水平的研究 目的：比較骨髓瘤

3、細(xì)胞系、CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞、MM患者及正常人基質(zhì)細(xì)胞LRP5/6、Kremen1/2及β-cateninmRNA水平，研究骨髓瘤細(xì)胞或重組DKK1蛋白對(duì)正常人基質(zhì)細(xì)胞上述基因mRNA水平的影響，以探討DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的作用。 方法：采用Westernblot及ELISA方法，檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞系、CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液DKK1蛋白表達(dá)情況，以及Realtime-PCR方法，檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞

4、系、CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞、MM患者及正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞LRP5/6、Kremen1/2及β-cateninmRNA水平以及骨髓瘤細(xì)胞或重組DKK1蛋白與正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)上述基因mRNA水平。 結(jié)論：骨髓瘤細(xì)胞、MM患者及正常人基質(zhì)細(xì)胞之間LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，而骨髓瘤細(xì)胞分泌的DKK1可能是造成MM患者基質(zhì)細(xì)胞上述基因變化的重要因素。 第三部分DKK1的

5、真核表達(dá)、純化及功能測(cè)定 目的：表達(dá)和純化DKK1蛋白，研究骨髓瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞DKK1相關(guān)受體表達(dá)情況，并探討DKK1對(duì)骨髓瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞效應(yīng)不同的可能機(jī)制。 方法：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1(-)-DKK1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用westernblot方法鑒定上清中的表達(dá)蛋白，使用Ni-AgroseHis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，純化融合His標(biāo)簽的DKK1蛋白。利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，對(duì)CD138+骨髓瘤細(xì)

6、胞、MM患者基質(zhì)細(xì)胞及健康志愿者基質(zhì)細(xì)胞表面DKK1相關(guān)受體表達(dá)情況進(jìn)行同步分析比較。胞LRP5/6和Kremen1/2mRNA水平顯著高于正常人基質(zhì)細(xì)胞和CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞。CD138+原代骨髓瘤細(xì)胞β-cateninmRNA水平高于MM患者及正常人基質(zhì)細(xì)胞。無(wú)論使用transwell小室或者直接接觸法進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞系RPMI-8226、NCI-H929與正常人基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)48h及72h，LRP5/6、Kremen1/2mR

7、NA水平明顯增加，β-cateninmRNA水平下降，但24h變化不明顯。72h與48h相比，上述基因mRNA水平變化更加明顯。重組DKK1蛋白濃度為100ng/ml及300ng/ml時(shí)，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)48h及72h后LRP5/6、Kremenl/2及β-cateninmRNA水平無(wú)明顯變化。重組DKK1蛋白濃度為500ng/ml時(shí)，培養(yǎng)48hLRP5/6mRNA水平有輕微上升(P＞0.05)，Kremenl/2mRNA水平有所上升(

8、P＜0.05)，及β-cateninmRNA水平略有下降(P＞0.05)；培養(yǎng)72hLRP5mRNA水平有所上升(P＜0.05)，LRP6mRNA水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)；Kremen1/2mRNA水平有所上升(P＜0.05)，及β-cateninmRNA水平明顯下降(P＜0.05)。重組DKK1蛋白濃度為700ng/ml時(shí)，培養(yǎng)48h及72hLRP5/6、Kremen1/2mRNA水平明顯上升(P＜0.05)，及β-cateni

9、nmRNA水平明顯下降(P＜0.05)。 結(jié)論：骨髓瘤細(xì)胞、MM患者及正常人基質(zhì)細(xì)胞之間LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，而骨髓瘤細(xì)胞分泌的DKK1可能是造成MM患者基質(zhì)細(xì)胞上述基因變化的重要因素。 第三部分DKK1的真核表達(dá)、純化及功能測(cè)定 目的：表達(dá)和純化DKK1蛋白，研究骨髓瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞DKK1相關(guān)受體表達(dá)情況，并探討DKK1對(duì)骨髓瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞效應(yīng)不同的可能機(jī)

10、制。 方法：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1(-)-DKK1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用westernblot方法鑒定上清中的表達(dá)蛋白，使用Ni-AgroseHis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，純化融合His標(biāo)簽的DKK1蛋白。利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，對(duì)CD138+骨髓瘤細(xì)胞、刪患者基質(zhì)細(xì)胞及健康志愿者基質(zhì)細(xì)胞表面DKK1相關(guān)受體表達(dá)情況進(jìn)行同步分析比較。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-DKK1體外轉(zhuǎn)染效率較高，