新型STAT3抑制劑K9抗多發(fā)性骨髓瘤的機(jī)理研究.pdf

1、目的：STAT3即信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一系列基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在多發(fā)性骨髓瘤中，STAT3被異常激活而失調(diào)，同時(shí)與臨床上骨髓瘤病人的不良預(yù)后和耐藥密切相關(guān)。目前，靶向STAT3信號(hào)通路來(lái)設(shè)計(jì)相關(guān)STAT3抑制劑已成為抗骨髓瘤藥物研發(fā)的新策略之一。本研究旨在通過(guò)高通量篩選方法發(fā)現(xiàn)新的STAT3抑制劑，并闡釋其抗骨髓瘤的作用機(jī)制，為臨床上靶向藥物治療多發(fā)性骨髓瘤提

2、供參考。
　　方法：⑴利用基于熒光素酶報(bào)告基因的高通量篩選方法，從56,000個(gè)小分子化合物中尋找新型STAT3抑制劑。⑵通過(guò)Immunoblotting技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)K9對(duì)多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)細(xì)胞凋亡的影響。⑶通過(guò)構(gòu)建裸鼠腫瘤異體移植模型，分析K9對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。⑷使用Immunoblotting技術(shù)，檢測(cè)K9對(duì)MM細(xì)胞本底以及IL-6所誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的影響；同時(shí)，通過(guò)M

3、M細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)K9對(duì)STAT3磷酸化的影響。⑸分別通過(guò)Immunoblotting技術(shù)、分子對(duì)接和體外酶活性測(cè)定方法，分析K9對(duì)STAT3上游各激酶活性的影響。⑹利用免疫共沉淀法和熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，檢測(cè)K9對(duì)STAT3二聚化以及轉(zhuǎn)錄活性的影響。⑺RT-PCR和Immunoblotting技術(shù)分析K9對(duì)STAT3靶基因MCL1和XIAP轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。⑻通過(guò)IL-6刺激實(shí)驗(yàn)和STAT3過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，考察過(guò)度激活或過(guò)

4、表達(dá)STAT3是否影響K9所誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡。⑼K9與阿霉素(DOX)進(jìn)行聯(lián)合用藥，考察K9是否影響DOX的抗腫瘤活性。
　　結(jié)果：①通過(guò)高通量篩選和前期實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物K9為候選的STAT3抑制劑。②Immunoblotting分析發(fā)現(xiàn)，K9能夠促進(jìn)MM細(xì)胞(NCI-H929、KMS12、OCI-My5、RPMI-8226和U266)中凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase3的剪切，進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，K9能夠誘導(dǎo)M

5、M細(xì)胞凋亡。③K9能夠抑制腫瘤異體移植模型中骨髓瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定裸鼠體重發(fā)現(xiàn)，給藥組與對(duì)照組體重沒(méi)有差別。另外，通過(guò)血液分析發(fā)現(xiàn)，給藥組中WBC、RBC、HGB和PLT與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，這些結(jié)果提示，K9在體內(nèi)的毒性較小。④STAT3在5種MM細(xì)胞中異常激活。同時(shí)，K9能夠有效抑制MM細(xì)胞中本底或者IL-6所誘導(dǎo)的STAT3的活化，而對(duì)STAT家族其它蛋白STAT1和STAT5的活化基本沒(méi)有影響。另外，MM細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)

6、胞共培養(yǎng)條件下，K9依然能夠抑制STAT3的活化。⑤K9通過(guò)特異性抑制STAT3信號(hào)通路上游激酶JAK2的活化來(lái)抑制STAT3信號(hào)通路，而對(duì)其它相關(guān)激酶的活化沒(méi)有影響，包括mTOR、P38、ERK和c-Src等。另外，分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，K9能夠很好地結(jié)合到 JAK2的活性口袋中，并能有效抑制JAK2的活化。⑥K9能夠有效抑制STAT3驅(qū)動(dòng)的pSTAT3-Luc熒光素酶活性，同時(shí)K9也能顯著抑制STAT3下游靶基因CCND2的啟動(dòng)子活性，

7、而對(duì)不含有STAT3結(jié)合單元的熒光素酶活性沒(méi)有影響。另外，K9對(duì)另一重要的轉(zhuǎn)錄因子NFκB所驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性也沒(méi)有影響。同時(shí)，Co-IP結(jié)果顯示，K9能夠有效抑制STAT3的二聚化。⑦RT-PCR和Immunoblotting技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，K9顯著抑制STAT3下游靶基因MCL1和XIAP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。⑧IL-6所誘導(dǎo)的STAT3的活化能夠部分抑制K9所誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的凋亡；同時(shí)，過(guò)表達(dá)STAT3后發(fā)現(xiàn)，其也能減弱K9對(duì)MM細(xì)胞的敏感性