暗飼養(yǎng)對(duì)視神經(jīng)橫熠SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層局部環(huán)路的影響.pdf

1、第一章 SD大鼠單純視神經(jīng)橫斷模型的解剖學(xué)基礎(chǔ)
　　目的：探究視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈與視神經(jīng)的關(guān)系，為建立穩(wěn)定可靠的SD大鼠視神經(jīng)橫斷損傷動(dòng)物模型提供解剖學(xué)依據(jù)。
　　方法：采用紅色乳膠灌注技術(shù)顯示正常SD大鼠視神經(jīng)周邊血管，體視顯微鏡下解剖分離眼動(dòng)脈、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈等，觀測(cè)視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的來源、分支、走行及其與視神經(jīng)的關(guān)系;根據(jù)測(cè)量結(jié)果在距眼球后極2.0 mm(n=6)、5.0 mm(n=6)及6.0 mm（n=6）處分別于鞘內(nèi)和

2、鞘外橫斷視神經(jīng)，采用明膠墨汁灌注技術(shù)顯示不同部位視神經(jīng)橫斷SD大鼠視網(wǎng)膜的血供，以評(píng)估不同部位橫斷視神經(jīng)對(duì)視網(wǎng)膜血供的影響。
　　結(jié)果：正常SD大鼠視神經(jīng)周邊血管均被紅色乳膠充分灌注而清晰顯示，眼動(dòng)脈位于視神經(jīng)的外側(cè)，由頸內(nèi)動(dòng)脈發(fā)出后朝前上內(nèi)繞過視神經(jīng)，并在視神經(jīng)干上方發(fā)出分支，包括視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈及內(nèi)、外睫狀動(dòng)脈等。視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈是眼動(dòng)脈最主要分支，其起點(diǎn)至眼球后極的距離為(5.784±0.054)mm。視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈繞到視神經(jīng)內(nèi)

3、側(cè)后，通過疏松結(jié)締組織與視神經(jīng)鞘緊貼在一起，在視神經(jīng)鞘內(nèi)伴視神經(jīng)干向前內(nèi)下走行。于眼球后極位置分出四條分支滋養(yǎng)眼球壁，主干穿眼球壁進(jìn)入視網(wǎng)膜，發(fā)出終支營(yíng)養(yǎng)視網(wǎng)膜。
　　明膠墨汁灌注結(jié)果顯示，距眼球后極6.0 mm處鞘內(nèi)橫斷視神經(jīng)組SD大鼠視網(wǎng)膜上單位面積主干血管數(shù)目高于其他部位視神經(jīng)橫斷組。
　　結(jié)論：SD大鼠視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈始終與視神經(jīng)伴行于視神經(jīng)鞘內(nèi)。制備SD大鼠視神經(jīng)橫斷損傷動(dòng)物模型時(shí)，距眼球后極6.0mm處鞘內(nèi)橫斷視神

4、經(jīng)最佳。
　　第二章暗飼養(yǎng)對(duì)視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用
　　目的：探討暗飼養(yǎng)對(duì)視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞、多巴胺能無長(zhǎng)突細(xì)胞及其突觸聯(lián)系等的作用和影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、假手術(shù)組及視神經(jīng)橫斷組，各組動(dòng)物依隨機(jī)分為兩半，一半常規(guī)飼養(yǎng)，一半暗飼養(yǎng)。通過Nissl染色方法觀測(cè)不同飼養(yǎng)條件下實(shí)驗(yàn)各組SD大鼠視網(wǎng)膜的層次結(jié)構(gòu)及節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與數(shù)目的改變;用免疫組化方法檢測(cè)不同飼養(yǎng)條件下各組動(dòng)物

5、視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞恢復(fù)蛋白（Recoverin）、Alpha蛋白激酶(PKC-α)、無長(zhǎng)突細(xì)胞絡(luò)氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)與變化;并運(yùn)用Western Blot方法檢測(cè)各組動(dòng)物視網(wǎng)膜TH蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.Nissl染色結(jié)果:常規(guī)飼養(yǎng)組SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層及節(jié)細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)排列在3d組開始出現(xiàn)紊亂，至14d組時(shí)，除了結(jié)構(gòu)排列紊亂，視網(wǎng)膜層次明顯變薄，單位面積視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目在7d組、14d組明顯減少;暗飼養(yǎng)組大鼠視網(wǎng)

6、膜各層結(jié)構(gòu)排列紊亂發(fā)生始于5d組，與常規(guī)飼養(yǎng)組相比時(shí)間有所延遲，單位面積視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少始于14d組。
　　2.PKC-α免疫熒光染色結(jié)果:PKC-α表達(dá)于雙極細(xì)胞胞體及突起上。視神經(jīng)橫斷后常規(guī)飼養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞胞體PKC-α的表達(dá)在3d組增強(qiáng)且高于正常組，在5d組、7d組回調(diào)到正常水平，14d組表達(dá)下降，未見PKC-α在胞體表達(dá)，但在內(nèi)網(wǎng)層的突觸上有表達(dá);暗飼養(yǎng)各組視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞胞體PKC-α的表達(dá)與正常組相似，但1

7、4d組表達(dá)下調(diào)，未見PKC-α在胞體表達(dá)，在內(nèi)網(wǎng)層的突觸有表達(dá)。
　　3.Recoverin免疫組化染色結(jié)果:視神經(jīng)橫斷后常規(guī)飼養(yǎng)的各組大鼠視網(wǎng)膜中，1d組的Recoverin表達(dá)上調(diào)，且高于正常水平，3d組表達(dá)下調(diào)到正常水平以下，5d組回調(diào)至正常水平，14d組Recoverin表達(dá)再下調(diào)。暗飼養(yǎng)1d組大鼠視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞Recoverin表達(dá)上調(diào)，且高于正常水平;3d組表達(dá)回調(diào)到正常水平，5d組、7d組大鼠視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞Rec

8、overin表達(dá)與正常組一致，14d組Recoverin表達(dá)明顯下調(diào)且低于正常水平。Recoverin免疫陽(yáng)性面積在視神經(jīng)橫斷后3d暗飼養(yǎng)組明顯高于常規(guī)飼養(yǎng)組。
　　4.TH免疫組化和Western Blot結(jié)果:常規(guī)飼養(yǎng)條件下，視網(wǎng)膜上TH表達(dá)1d組、3d組、5d組逐漸下調(diào)，5d組達(dá)最低值，而7d組TH表達(dá)回調(diào)到正常水平;暗飼養(yǎng)條件下視網(wǎng)膜TH表達(dá)1d組下調(diào)，3d組開始回調(diào)，5d組回調(diào)至正常水平。Western Blot結(jié)果與免

9、疫組化結(jié)果基本一致。
　　5.TH和PKC-α熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:視神經(jīng)橫斷后無長(zhǎng)突細(xì)胞與雙極細(xì)胞的突觸聯(lián)系逐漸減少，5d組最低、14d組稍有恢復(fù)，但遠(yuǎn)未恢復(fù)到正常水平。暗飼養(yǎng)條件下的5d組、14d組視網(wǎng)膜TH和PKC-α共表達(dá)的突觸數(shù)均高于同一時(shí)間點(diǎn)的常規(guī)飼養(yǎng)條件下各組。
　　結(jié)論:暗飼養(yǎng)對(duì)視神經(jīng)橫斷后SD大鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞和DA能無長(zhǎng)突細(xì)胞以及其突觸聯(lián)系等有保護(hù)作用。
　　第三章暗飼養(yǎng)保護(hù)ONT大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層

10、局部環(huán)路結(jié)構(gòu)的可能機(jī)制
　　目的：通過比較不同飼養(yǎng)條件下ONT大鼠視網(wǎng)膜GAD67、BDNF及其受體trkB的表達(dá)，分析其與視網(wǎng)膜視覺通路神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能改變的關(guān)系，探討暗飼養(yǎng)對(duì)視神經(jīng)橫斷后SD大鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞和DA能無長(zhǎng)突細(xì)胞以及其突觸聯(lián)系等保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法與第二章一樣，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、假手術(shù)組及視神經(jīng)橫斷組，各組動(dòng)物按飼養(yǎng)條件隨機(jī)分為兩半，一半常規(guī)飼養(yǎng)，一半暗飼養(yǎng)。根據(jù)第一章實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備SD大鼠

11、視神經(jīng)橫斷動(dòng)物模型，用免疫組化染色方法分析不同飼養(yǎng)條件下視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜上谷氨酸脫羧酶(GAD)、BDNF及其受體trkB等的表達(dá)和變化。
　　結(jié)果：
　　1.GAD67免疫組化結(jié)果:常規(guī)飼養(yǎng)條件下，視神經(jīng)橫斷后GAD67的表達(dá)于1d組開始上調(diào)，3d組上調(diào)達(dá)峰值，5d組表達(dá)下調(diào)。與常規(guī)飼養(yǎng)條件下相同時(shí)間點(diǎn)比較，暗飼養(yǎng)條件下1d組、3d組GAD67的表達(dá)水平均高于常規(guī)飼養(yǎng)條件下同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組。
　　2.BDNF免疫

12、組化結(jié)果:常規(guī)飼養(yǎng)條件下，視神經(jīng)橫斷后各組SD大鼠視網(wǎng)膜BDNF陽(yáng)性表達(dá)自3d組起逐漸減弱，BDNF陽(yáng)性節(jié)細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。暗飼養(yǎng)條件下，視神經(jīng)橫斷后各組SD大鼠視網(wǎng)膜BDNF陽(yáng)性表達(dá)自7d組開始逐漸減弱。
　　3.trkB免疫組化結(jié)果:常規(guī)飼養(yǎng)條件下，視神經(jīng)橫斷后實(shí)驗(yàn)各組SD大鼠視網(wǎng)膜trkB免疫陽(yáng)性表達(dá)1d組上調(diào)超過正常水平，3d組下表達(dá)調(diào)，且遠(yuǎn)低于正常水平，以后各實(shí)驗(yàn)組逐漸回調(diào)，但仍低于正常水平;暗飼養(yǎng)條件下，實(shí)驗(yàn)各組SD大