α晶體蛋白對視神經(jīng)損傷微環(huán)境中視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的作用研究.pdf

1、α晶體蛋白是晶狀體來源的“神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)”之一，它能有效的保護(hù)視神經(jīng)損傷后RGCs細(xì)胞并促進(jìn)軸突的再生；近年來損傷后RGCs周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞在其再生和修復(fù)中的作用受到人們的關(guān)注。已有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥、缺血、變性疾病及損傷后可被激活，一方面產(chǎn)生大量的超氧陰離子、一氧化氮、花生四烯酸衍生物、興奮性氨基酸以及其它一些潛在的神經(jīng)毒素，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，從而加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理損傷；另一方面可以吞噬死亡的神經(jīng)元碎屑，起到清

2、除的作用。在既往研究中我們意外觀察到，α晶體蛋白在保護(hù)RGCs的同時，可以抑制視神經(jīng)鉗夾傷模型中吞噬熒光金的小膠質(zhì)細(xì)胞，那么這種作用是直接還是間接的，小膠質(zhì)細(xì)胞的減少對RGCs的保護(hù)是否有益?目前尚不清楚。 目的： 通過離體實驗和在體模型，觀察α晶體蛋白對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、活化以及分布的影響，并在蛋白和mRNA水平檢測α晶體蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞激活時分泌的TNF-α和iNOS表達(dá)的影響，分析α晶體蛋白對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞

3、與RGCs變化的相關(guān)性，為α晶體蛋白對視神經(jīng)損傷后RGCs的保護(hù)提供新的理論依據(jù)，為臨床治療探索可行性方法。 方法： 1.通過視網(wǎng)膜混合細(xì)胞培養(yǎng)和恒溫?fù)u床震蕩分離的方法培養(yǎng)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，并通過免疫組化、掃描電鏡、流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度。 2.離體實驗：以離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞為對象，用不同濃度LPS和α晶體蛋白干預(yù)，通過MTT分析，細(xì)胞計數(shù)法摸索合適的LPS、α晶體蛋白工作濃度，研究α晶體蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖

4、、活化的影響；并通過RT-PCR，ELISA、熒光定量PCR等方法，分析小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α，iNOS的表達(dá)變化。 3.在體實驗：以成年LongEvans大鼠為研究對象，建立視神經(jīng)鉗夾損傷模型，玻璃體腔注射10-4g/Lα晶體蛋白，并設(shè)立牛血清白蛋白注射為陰性對照；通過視網(wǎng)膜組織切片和全視網(wǎng)膜鋪片免疫組化的方法，在損傷后1、2、3、4、6、8周觀察α晶體蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、分布、數(shù)量的影響，并分析其與RGCs變化的相互

5、關(guān)系。另外，在傷后3周時重復(fù)注射α晶體蛋白了解重復(fù)注射是否可以抑制視神經(jīng)損傷4-8周的小膠質(zhì)細(xì)胞，保護(hù)RGCs；并通過werstemblot分析各組在損傷后1、2、4、8周視網(wǎng)膜TNF-α，iNOS蛋白釋放的情況。 結(jié)果： 1.通過視網(wǎng)膜混合細(xì)胞培養(yǎng)和恒溫?fù)u床震蕩分離的方法，成功原代培養(yǎng)并鑒定Long-Evans大鼠的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞：應(yīng)用GSA-IB4與CD11b細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞的純度分別為94.5％、

6、95.8％和91.7％，并且在掃描電鏡觀察細(xì)胞表面呈樹突樣外觀，表明本培養(yǎng)方法可以得到純度較高的小膠質(zhì)細(xì)胞。 2.與正常對照組相比，濃度為10-2g/L至10-6g/LLPS均可刺激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化(P＜0.01-0.05)，10-4g/Lα晶體蛋白可以抑制10-6g/LLPS對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化(P＜0.05)。 3.α晶體蛋白可以降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活時細(xì)胞上清中TNF-α蛋白的濃度(P＜0.01-

7、0.05)，減少NO的釋放(P＜0.05)；并降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活時TNF-α、iNOSmRNA的表達(dá)。 4.玻璃體腔注射10-4g/L的α晶體蛋白，與牛血清白蛋白注射組比較，在損傷后1-4周可顯著減少視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(p＜0.05)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和向活化阿米巴樣形態(tài)的轉(zhuǎn)變，而在損傷后6-8周α晶體蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用不明顯。在損傷3周重復(fù)注射α晶體蛋白，與單次注射組比較，小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)無明顯改變；但在傷后4周小

8、膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(p＜0.05)，傷后6-8周兩組間比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。 5.在傷后1-4周，α晶體蛋白可顯著減少視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(p＜0.05)，同時增加RGCs細(xì)胞的數(shù)量，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷后α晶體蛋白對兩種細(xì)胞的影響存在直線相關(guān)。 6.與牛血清白蛋白組比較，損傷后1-4周α晶體蛋白可以降低視網(wǎng)膜TNF-α，iNOS的蛋白的表達(dá)(P＜0.01-0.05)，損傷后8周，兩組間比較無統(tǒng)

9、計學(xué)意義(p＞0.05)。 結(jié)論： 1.通過視網(wǎng)膜混合細(xì)胞培養(yǎng)和恒溫?fù)u床震蕩分離的方法，可以成功培養(yǎng)出純度高的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。 2.α晶體蛋白可以直接抑制離體培養(yǎng)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，并降低細(xì)胞上清中TNF-α、iNOS蛋白的濃度及mRNA的表達(dá)，提示可能在病理的情況下，α晶體蛋白可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、iNOS，減輕其對RGCs的損害。 3.α晶體蛋白對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用