營(yíng)養(yǎng)脅迫下耐輻射異常球菌全局調(diào)控蛋白CarD的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、營(yíng)養(yǎng)脅迫是細(xì)菌生理過(guò)程中最普遍的環(huán)境脅迫因子，細(xì)菌通過(guò)控制rRNA合成以及信號(hào)分子(p)ppGpp介導(dǎo)的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，快速改變基因的表達(dá)，以適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的變化。已有研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌存在類似于真核HMGA(high-mobility group A)的全局調(diào)控蛋白CarD，在細(xì)菌參與營(yíng)養(yǎng)脅迫和非生物脅迫反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)具有對(duì)極端惡劣環(huán)境極強(qiáng)的適應(yīng)能力，基因組序列分析顯示

2、該菌含有一個(gè)CarD蛋白。但是，耐輻射異常球菌CarD是否參與細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)脅迫反應(yīng)的調(diào)控，以及如何控制rRNA以及(p)ppGpp合成的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建耐輻射異常球菌CarD突變株、表型分析、β-半乳糖苷酶活性測(cè)定、qRT-PCR、CHIP、蛋白質(zhì)組學(xué)等對(duì)CarD在營(yíng)養(yǎng)等脅迫反應(yīng)的調(diào)控進(jìn)行了研究，取得如下結(jié)果:
　　1.CarD蛋白序列同源比較顯示異常球菌屬的CarD蛋白具有很高的相似性，在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中來(lái)源于同

3、一個(gè)祖先。耐輻射異常球菌與已報(bào)道的其他屬細(xì)菌CarD相似性最高的是Thermusaquaticus，與粘細(xì)菌、分枝桿菌的CarD親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于不同的進(jìn)化分支。粘細(xì)菌CarD共316個(gè)氨基酸，與CarG蛋白形成全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體，而分枝桿菌和耐輻射異常球菌沒(méi)有類似CarG的蛋白質(zhì)，而且CarD長(zhǎng)度比較短，分別為162和169個(gè)氨基酸。分枝桿菌和耐輻射異常球菌的CarD蛋白相似性也很低(26％)。由此推測(cè)耐輻射異常球菌CarD與已報(bào)道的

4、粘細(xì)菌、分枝桿菌的CarD功能存在差異。
　　2.在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，carD基因的表達(dá)顯著增加（2倍以上），表明carD基因受營(yíng)養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)。為了研究耐輻射異常球菌CarD的功能，我們構(gòu)建了carD缺失突變株、回補(bǔ)株和過(guò)表達(dá)菌株，發(fā)現(xiàn)在正常條件和營(yíng)養(yǎng)脅迫下，carD基因缺失均導(dǎo)致16S rRNA基因表達(dá)上調(diào)2倍以上;而relA基因在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下表達(dá)顯著下調(diào)（2倍）。利用報(bào)告基因lacZ分析16S rRNA和relA基因啟動(dòng)子活性的

5、結(jié)果表明CarD抑制16S rRNA合成、激活relA基因表達(dá)。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CarD蛋白與16S rRNA和relA基因啟動(dòng)子互作。為進(jìn)一步研究CarD調(diào)控作用，我們構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)菌株，發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)脅迫下生長(zhǎng)速率下降，對(duì)熱脅迫敏感，UV輻射抗性增強(qiáng)，與carD缺失突變株的表型一致。此外，我們構(gòu)建了(p)ppGpp合成/水解酶缺失突變株，由于耐輻射異常球菌有2個(gè)與(p)ppGpp合成/水解酶相關(guān)

6、的基因（relA和relQ），通過(guò)對(duì)relA和relQ單、雙突變株及回補(bǔ)株的細(xì)胞生長(zhǎng)分析發(fā)現(xiàn)relA和relQ缺失突變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基酸饑餓、H2O2和熱脅迫敏感，與carD缺失突變株的表型一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)relA和relQ雙突變菌株不能在限制性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而過(guò)量表達(dá)合成酶基因（relQ）或RelA合成保守結(jié)構(gòu)域片段（編碼RelA N'端HDc和RSD結(jié)構(gòu)域的DNA序列）導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)能力顯著下降。已有的研究表明(p)ppGpp作為信

7、號(hào)分子通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)速率進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有(p)ppGpp合成和水解酶活性雙功能的RelA在控制細(xì)胞內(nèi)(p)ppGpp含量發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此，在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，耐輻射異常球菌CarD通過(guò)激活relA基因表達(dá)，控制細(xì)胞內(nèi)(p)ppGpp的含量，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　3.研究結(jié)果表明耐輻射異常球菌CarD與至今研究最為深入的分枝桿菌和粘細(xì)菌的CarD之間具有類似的功能，同時(shí)存在一定差異。酵母雙雜實(shí)驗(yàn)顯示耐輻射異常球菌CarD

8、與RAN聚合酶β'亞基互作，這與分枝桿菌的研究結(jié)果相符;粘細(xì)菌中CarD受藍(lán)光誘導(dǎo)，參與類胡蘿卜素的合成調(diào)控，而耐輻射異常球菌CarD受營(yíng)養(yǎng)、氧化和UV脅迫誘導(dǎo)。并且，CarD除參與營(yíng)養(yǎng)脅迫反應(yīng)的調(diào)控外，還直接或間接地參與氧化、UV輻射等脅迫反應(yīng)。CarD作為全局調(diào)控蛋白參與多重脅迫反應(yīng)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，耐輻射異常球菌CarD在逆境脅迫尤其是營(yíng)養(yǎng)脅迫過(guò)程中通過(guò)負(fù)調(diào)控16S rRNA基因表達(dá)，或激活(p)p