耐輻射球菌細胞內錳離子水平調控相關蛋白研究.pdf

1、細菌細胞內的金屬離子動態(tài)平衡與細胞的生理生長具有密切關系,許多過渡價態(tài)金屬離子,包括Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)等,不但可以作為蛋白的輔因子參與細胞的多種氧化還原反應,還可以作為信號因子參與基因組轉錄調控,影響細胞的毒性以及極端抗性等。因此細胞內金屬離子的調控對于細菌維持正常生理活動至關重要,而關于細菌細胞內金屬離子調控的研究也一直是微生物領域的熱點。
　　 作為極端微生物家族的重要成員,耐輻射球菌對于電離輻射

2、、紫外線、化學誘變劑、干燥等具有極強抗性,而越來越多的研究表明,耐輻射球菌對于極端環(huán)境的適應能力得益于其超強的抗氧化能力,其細胞內積累的超高錳離子水平一直被認為是其最重要的抗氧化機制之一,因此耐輻射球菌是極好的研究細菌細胞錳離子代謝調控的模式生物,通過研究其錳離子調控機制,不但可以進一步了解耐輻射球菌的極端抗性機制,而且對于拓展細菌細胞金屬離子調控機制也具有重要意義。本文主要通過細胞吸收及外排兩個方面,研究了耐輻射球菌的細胞內錳離子動態(tài)

3、調控機制,研究結果如下:
　　 1.我們首次鑒定得到耐輻射球菌錳離子外排蛋白(Dr1236)。在構建了Dr1236的基因缺失突變株后,我們發(fā)現(xiàn)突變株對于錳離子的抗性下降,而且細胞內的錳離子水平顯著升高,說明Dr1236在耐輻射球菌錳離子抗性及細胞內錳離子動態(tài)調控機制中,發(fā)揮了重要的作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),突變株細胞內錳離子濃度升高以后,其電離輻射、紫外、過氧化氫抗性都明顯增強,表明細胞內錳離子確實參與了細胞的極端抗性,而這種保護

4、作用很可能是通過降低自由基對蛋白的攻擊實現(xiàn)的。然而,雖然突變株細胞在積累了高水平錳離子之后,極端抗性有了不同程度的增加,但是細胞的生長周期卻遠遠短于野生株,表明錳離子的過高積累對細胞的整體機能造成了損傷,這也從側面反映出錳離子外排蛋白對于細胞的重要作用。
　　 2.dr0865編碼了耐輻射球菌唯一一個Fur同源蛋白,Fur蛋白在其它細菌中參與了錳離子吸收通道蛋白的轉錄調控,因此我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng)體外表達了dr0865,并研

5、究了其生化性質。生物信息學研究表明,Dr0865很可能包含了結合三個金屬離子的結構,這種結構可能賦予了其獨特的生物學功能。DNA結合活性實驗表明,Dr0865可以與dr2283、dr2284、dr2524的啟動子結合,而且結合活性與金屬離子的濃度成正比,另一方面卻不能與dr1709的啟動子結合；β-半乳糖甘酶活性實驗表明Dr0865與dr2283、dr2284、dr2523的啟動子的結合可能促進了其轉錄,考慮到Dr0865的DNA結合活

6、性依賴于金屬離子的濃度,及Dr0865突變株的過氧化氫抗性增強,因此我們推測dr2283、dr2284、dr2523很可能編碼了一種鐵離子外排通道蛋白,而其具體調控機制還需要進一步研究。
　　 3.dr2539編碼耐輻射球菌的DtxR／MntR家族蛋白,這類蛋白家族對于細胞錳離子或鐵離子調控至關重要,通過在Dr2539 N-端融合表達助溶片段IF,我們成功得到Dr2539蛋白。DNA結合活性實驗表明,Dr2539只能與dr170

7、9的啟動子結合,而且EMSA和β-半乳糖甘酶活性實驗表明,蛋白的結合活性受到錳離子和鐵離子的調控,表明Dr2539與此前所報道的MntR蛋白結構上可能存在很大差異,因此我們構建了Dr2539突變體,并將突變體補償Dr2539突變株,包括C-D11M、C-H98Y、C-E101D、C-Tru,通過檢測補償株對于錳離子的抗性,發(fā)現(xiàn)C—D11M及C—Tru錳離子抗性相對于野生Dr2539補償株明顯下降,而C-E101D的抗性并沒有明顯變化；驚

8、奇的是,H98Y補償株對6-7Mm Mn(Ⅱ)極度敏感,這與此前所報道的DtxR激活模型一致,因此我們推測,dr2539所編碼的MntR蛋白很可能利用一種類似于DtxR的激活模式,而且可能參與了細胞內錳離子與鐵離子動態(tài)平衡的調控。
　　 綜上所述,在研究了耐輻射球菌細胞內錳離子外排和吸收系統(tǒng)后,我們的結果表明錳離子的確參與了耐輻射球菌的極端抗性機制,此外,金屬離子調控蛋白Dr0865和Dr2539的生化活性表明,耐輻射球菌的金屬