耐輻射異常球菌鐵蛋白DrfE的抗氧化功能分析.pdf

1、鐵是生物體正常生長不可或缺的元素，而細胞內(nèi)過量的鐵離子會引起Fenton反應而產(chǎn)生ROS，從而導致細胞氧化損傷。已有研究表明生物體中，鐵蛋白具有氧化脅迫抗性、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵離子濃度等作用。極端耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)抗氧化基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)一個的類鐵蛋白編碼基因(drB0118)，已有的研究表明該蛋白失活導致細胞對干燥脅迫敏感，但在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵離子濃度及氧化脅迫抗性的作用尚無報道。本研究通過生物信

2、息學分析、基因突變和異源表達等方法對DrfE蛋白的抗氧化功能進行初步研究，主要取得如下研究結(jié)果：
　　(1)利用生物信息學方法，對耐輻射異常球菌DrfE進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)drfE位于耐輻射異常球菌基因組大質(zhì)粒上，該蛋白由337個氨基酸組成，含有一個與鐵蛋白類似保守結(jié)構(gòu)域，屬于鐵蛋白2超家族。因此，將該蛋白命名為DrfE(Deinococcus radiodurans Ferritin，DrfE)。其氨基酸序列分析表明，該蛋白

3、具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白疏水區(qū)，是一類典型的跨膜蛋白。
　　(2)為了研究耐輻射異常球菌 drfE的功能，本研究采用融合PCR和體內(nèi)同源重組的方法成功構(gòu)建了drfE基因的缺失突變株（ΔdrfE）和功能回補菌株（pdrfE::Δ）。脅迫沖擊實驗顯示，drfE基因缺失導致耐輻射異常球菌對氯化鈉和過氧化氫敏感，80mM H2O2處理30min后，突變株比野生型菌株的生存力低4個數(shù)量級，5M NaCl處理6h導致突變株的生存力降低2個數(shù)量

4、級，且回補株能夠完全恢復突變株ΔdrfE的表型。
　　(3)對野生型DR、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE::Δ中體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性測定的結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，drfE基因缺失導致耐輻射異常球菌CAT和SOD活性下降(突變株的酶活分別下降28.36％和6.42%)；而氧化脅迫(80mM H2O2處理30min)條件下,差異尤為顯著(突變株酶活下降32.33%和41.30%)。進一步對胞

5、內(nèi)Fe2+含量進行測定，結(jié)果顯示drfE基因缺失引起耐輻射異常球菌細胞中胞內(nèi)Fe2+含量增加了26%，達293μmol/L。
　　(4)將耐輻射異常球菌DrfE蛋白異源表達在大腸桿菌中，表型分析結(jié)果表明，DrfE蛋白明顯增強了大腸桿菌對氯化鈉和過氧化氫的脅迫抗性。在15mM H2O2處理10min條件下，DrfE蛋白異源表達的大腸桿菌生存力增加了2個數(shù)量級，1.5M NaCl處理6h條件下，其生存力增加1個數(shù)量級。
　　總之