輸尿管部分梗阻大鼠腎臟不可逆損傷分泌蛋白質(zhì)標(biāo)記物初步篩查研究.pdf

1、前言:
　　 隨著發(fā)達(dá)國家產(chǎn)前超聲的應(yīng)用增加和普及,新生兒中先天性梗阻性腎病的檢出率逐漸增加。普遍認(rèn)為梗阻性腎病是腎盂和集合系統(tǒng)內(nèi)尿液蓄積誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎積水導(dǎo)致的結(jié)果。盡管梗阻性腎病的病因不清,但是最常見的原因是腎盂輸尿管連接部(Uretero pelvic junction,UPJ)梗阻,這是兒童泌尿外科常見的疾病,盡管全世界很多研究人員致力于該病的基礎(chǔ)和臨床研究,但仍然存在很多亟待解決的問題。如何治療UPJ梗阻的新生兒一直處于

2、爭論中。在20世紀(jì)80年代晚期之前,為了避免腎臟功能惡化,先天性輸尿管梗阻的新生兒治療原則都是生后立即進(jìn)行手術(shù)。然而,臨床上觀察到很多UPJ患兒腎積水可以自發(fā)消失,并不出現(xiàn)腎功能喪失或腎臟發(fā)育異常。鑒于這種情況,就需要修改UPJ梗阻新生兒的治療規(guī)范。目前,很多臨床醫(yī)生對于UPJ梗阻新生兒多采取保守觀察的態(tài)度,只有當(dāng)檢測到腎臟功能減退時才采取外科手術(shù)干預(yù)。盡管這種治療態(tài)度避免了很多不必要的外科干預(yù),但還是存在三大方面的問題:(1)目前臨床

3、上應(yīng)用的檢測腎功能損傷程度的檢查方法還不完善;(2)這些檢查方法多是有創(chuàng)性的,而且需要UPJ梗阻患兒在生后的最初一年內(nèi)反復(fù)接受檢查來評價腎功能受損程度;(3)部分輸尿管梗阻對腎臟功能造成的遠(yuǎn)期影響知之甚少,保守觀察過程中即使密切隨訪也存在造成腎臟不可逆損傷的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 目前,國內(nèi)外對于先天性腎積水的診斷和手術(shù)時機(jī)的選擇仍依賴于影像學(xué)檢查方法,將新生兒腎積水隨訪過程中腎積水程度加重或出現(xiàn)腎臟功能惡化作為手術(shù)的指征,還沒有無創(chuàng)性生

4、物學(xué)標(biāo)記物檢查可以早期診斷腎臟不可逆損傷和輸尿管梗阻,從而減少或替代臨床現(xiàn)行的有創(chuàng)性檢查。因此,對于新生兒腎積水以及梗阻性腎病,目前臨床上需要篩選一種輸尿管梗阻后腎臟不可逆損傷的特異性標(biāo)志物,早期發(fā)現(xiàn)腎臟不可逆損傷,并給予及時手術(shù)治療和臨床干預(yù),減輕腎臟損傷,以保存剩余的腎臟功能。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)組成和變化的新學(xué)科,它對于疾病的早期診斷和發(fā)病機(jī)制都具有重要意義。分泌蛋白質(zhì)組屬于亞蛋白質(zhì)組的一員,是指能夠分

5、泌到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)總和,近年來多應(yīng)用于血清和尿液中疾病標(biāo)志物的研究。腎臟病理性改變經(jīng)常由腎臟組織的破壞和重塑引起,這些組織上的異常也會引起某些蛋白表達(dá)水平的改變。由于腎臟疾病而產(chǎn)生的蛋白都能以原形或降解的的肽段的形式出現(xiàn)在尿液中,使尿液呈現(xiàn)特異的蛋白質(zhì)譜,這種蛋白質(zhì)譜的出現(xiàn)可反應(yīng)疾病的病理生理過程。同時,由于尿液蛋白質(zhì)譜的改變可能早于臨床癥狀的出現(xiàn),使之有可能成為預(yù)測或早期診斷疾病的手段。
　　 許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明腎小管上皮

6、細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腎臟發(fā)生纖維化的一個關(guān)鍵步驟,腎臟小管上皮細(xì)胞表型的改變和缺失可能啟動了腎臟不可逆損傷。因此本研究以此為突破點(diǎn),研究腎臟小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化即腎臟發(fā)生不可逆損傷前后的體液(血清、尿液)中分泌蛋白質(zhì)組,篩查輸尿管梗阻后腎臟不可逆損傷的特異性標(biāo)志物。
　　 表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspect

7、rometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)是一種高通量、高靈敏的蛋白質(zhì)檢測技術(shù),檢測所需樣本量少、自動化程度高,可以檢測樣本中低豐度蛋白,為體液中分泌蛋白質(zhì)檢測提供了一個很好的技術(shù)平臺,目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、遺傳性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、腎臟疾病的基礎(chǔ)研究。本研究擬應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù),檢測正常大鼠、輸尿管部分梗阻大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化組的血清、尿液,與體外腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果對比分析,篩選出一組特異

8、性標(biāo)志物,為先天性腎積水及梗阻性腎病選擇適宜的手術(shù)及治療時機(jī)提供依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料:
　　 一、實(shí)驗(yàn)動物
　　 SPF級SD大鼠(140-160g)6只,SPF級SD大鼠(100-120g)78只,由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
　　 二、實(shí)驗(yàn)試劑
　　 兔抗大鼠細(xì)胞角蛋白抗體(CKl8)(北京博奧森,中國)
　　 兔抗大鼠E鈣粘蛋白抗體(E-cadherin)(北京博奧

9、森,中國)
　　 小鼠抗大鼠平滑肌細(xì)胞肌動蛋白抗體(α-SMA)(武漢博士德,中國)
　　 兔抗大鼠波形蛋白抗體(Vimentin)(北京中杉,中國)
　　 FITC標(biāo)記羊抗兔抗體(北京中杉,中國)
　　 羅丹明標(biāo)記羊抗小鼠抗體(康為世紀(jì),中國)
　　 DAPI染色液(Sigma,USA)
　　 胰蛋白酶(Sigma,USA)
　　 胎牛血清(Hyclone,美國)
　　

10、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone,美國)
　　 胰島素(Sigma,美國)
　　 氫化可的松(赤峰蒙欣藥業(yè))
　　 青霉素(華北制藥廠)
　　 鏈霉素(華北制藥廠)
　　 三氟乙酸;醋酸鈉;二硫蘇糖醇;3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽;尿素;乙腈;飽和芥子酸。(Sigma,美國)
　　 三、蛋白質(zhì)芯片
　　 選用SELDI蛋白質(zhì)芯片中CM10芯片,CM10芯片

11、是弱陽離子親和芯片WCX2芯片的改進(jìn)型。購于美國Ciphergen公司。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠(n=48)隨機(jī)分為梗阻12小時、1天、2天、3天、5天、7天等6個時間段組,每組8只,空白對照組(n=30),制作輸尿管部分梗阻模型,于不同時間點(diǎn)分別處死大鼠,分別取雙側(cè)。腎臟制作石蠟切片、腹主動脈穿刺獲取血清,腎盂或膀胱穿刺獲取尿液,-80攝氏度保存。應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)方法確定動物模型中腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

12、化的時間點(diǎn),同時原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞,利用吹吸方法使腎小管上皮細(xì)胞在流體機(jī)械力作用下發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,取轉(zhuǎn)化前后的細(xì)胞培養(yǎng)上清,分裝,-80攝氏度凍存。選取動物模型腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化前后收集的尿液、血清標(biāo)本以及體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化前后細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選出三種不同樣本腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化前后的標(biāo)志物。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功建立了大鼠單側(cè)輸尿管部分梗阻(PUUO)模型。

13、r>　　 2、大鼠PUUO模型的手術(shù)側(cè)腎臟可用于研究腎間質(zhì)纖維化。
　　 3、大鼠腎間質(zhì)纖維化過程中腎小管上皮細(xì)胞存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
　　 4、間歇性流體機(jī)械力可以使體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
　　 5、發(fā)現(xiàn)輸尿管部分梗阻大鼠血清中有27種蛋白質(zhì)標(biāo)記物,其中10種蛋白質(zhì)高表達(dá),17種蛋白質(zhì)低表達(dá)。輸尿管部分梗阻大鼠尿液中共檢測到27種蛋白質(zhì)標(biāo)記物,有8種蛋白質(zhì)高表達(dá),19種蛋白質(zhì)低表達(dá)。

14、體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化前后培養(yǎng)上清共有10個差異蛋白峰,腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后10種蛋白質(zhì)均低表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 大鼠PUUO術(shù)后3天即有腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物,發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,即發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,隨梗阻時間延長,腎臟中發(fā)生轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細(xì)胞逐漸增多。
　　 大鼠腎小管上皮細(xì)胞在流體機(jī)械力誘導(dǎo)下向成纖維樣細(xì)胞分化,從而可能在流體機(jī)械力介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中起作用。
　　 應(yīng)用SEL