原代大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)學(xué)初步研究.pdf

1、該研究通過(guò)建立星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型,利用雙向電泳技術(shù)獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后差異表達(dá)蛋白,探求損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的一系列應(yīng)答反應(yīng)及蛋白水平上的動(dòng)態(tài)變化.我們采用原代脊髓膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究以模擬脊髓損傷時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的變化.新生的Wistar大鼠,分離脊髓,剝除脊膜,取出脊髓至解剖液,然后用煎刀煎碎,再用胰酶消化,輕輕吹打后吹散脊髓組織,差度離心法富集膠質(zhì)細(xì)胞.然后進(jìn)行全脊髓混合培養(yǎng),混合培養(yǎng)至第12天后通過(guò)機(jī)械振搖、玻璃培養(yǎng)瓶反復(fù)貼壁

2、及調(diào)整接種密度等方法去除其它細(xì)胞,得到較純的星形膠質(zhì)細(xì)胞.我們采用GFAP免疫熒光方法標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)記數(shù),檢查培養(yǎng)純度.為了研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的作用,需要建立能再現(xiàn)損傷和再生過(guò)程的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在進(jìn)行IPG等民聚焦時(shí),我們最終確定30,000Vhr作為控制一向的條件.在SDS-PAGE凝膠電泳時(shí)采用了優(yōu)化后的凝及配制方法,同時(shí)在電泳時(shí)采用固定膠條位置的方法,提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性.在該研究的染色程序中,所有染色時(shí)間均控制在4分

3、鐘以內(nèi).在星形膠質(zhì)細(xì)胞的雙向電泳圖譜中,70％以上的蛋白集中分布在MW30-69kDa的范圍內(nèi);約有60左右的蛋白集中分布在pI3.0-6.4的范圍內(nèi).同時(shí)也可看到脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后的不同時(shí)間其蛋白表達(dá)表現(xiàn)出了差異,其中在損傷后的圖譜中有一定的相似性.該論文對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn),以使其能符合雙向電泳研究的需要,并從形態(tài)學(xué)及免疫熒光兩方面進(jìn)行了驗(yàn)證.同時(shí)新設(shè)計(jì)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械損傷模型,使其無(wú)論在損傷程度還