人源飼養(yǎng)層對(duì)人胚胎干細(xì)胞支持情況的研究.pdf

1、1998年Thomson首次報(bào)道從人的囊胚中獲得發(fā)育全能的人胚胎干細(xì)胞，引起了世界各國(guó)的熱切關(guān)注。建立核移植來(lái)源的胚胎干細(xì)胞系，進(jìn)行治療性克隆更是當(dāng)代生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)!胚胎干細(xì)胞在發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞治療、組織替代等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的研究前景，同時(shí)也為基因功能研究、藥物篩選和新藥開(kāi)發(fā)提供了良好的工具。 胚胎干細(xì)胞來(lái)自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)而保持未分化狀態(tài)及發(fā)育全能性。傳統(tǒng)上，需要鼠胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層，才能維持其未分化

2、狀態(tài)。這可能將鼠類(lèi)病毒傳染給患者。干細(xì)胞治療人類(lèi)疾病時(shí)，必須要求無(wú)動(dòng)物源性培養(yǎng)，以避免鼠源性病毒可能帶來(lái)的危害。 為減少外源性動(dòng)物成份，本研究選用包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管、胎兒皮膚、肌肉，HAF(人乳腺永生細(xì)胞，昆明動(dòng)物研究所贈(zèng)送)7種不同的胎兒、小兒及成人組織作飼養(yǎng)層，比較了它們對(duì)人胚胎干細(xì)胞的支持情況；并在來(lái)源于包皮的飼養(yǎng)層上成功地建立了一株新的人胚胎干細(xì)胞系。建系內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來(lái)自知情同意的體外受精病人廢棄的胚胎，包皮來(lái)自小

3、兒外科包皮環(huán)切術(shù)。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，這株新系已傳到27代，核型正常(46XX)且保持全部胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特征：多能性、高度自我更新能力及未分化狀態(tài)，高度表達(dá)堿性磷酸酶活性，表達(dá)常用于人胚胎干細(xì)胞鑒定的分子標(biāo)記： Oct-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81等。 第1部分 飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng) [目的]： 1.原代培養(yǎng)包皮真皮、子宮內(nèi)膜基質(zhì)、絨毛、輸卵管、胎兒真皮、胎兒肌肉及胎鼠成纖維細(xì)

4、胞。 2.傳代及大量?jī)龃嫔鲜黾?xì)胞以備接種人胚胎干細(xì)胞。 3.比較不同組織學(xué)來(lái)源的細(xì)胞生物學(xué)特征。 [方法]： 1.無(wú)菌條件下取胎鼠及病人術(shù)后廢棄的包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管、胎兒皮膚、胎兒肌肉。 2.剪碎所需培養(yǎng)的組織，用胰酶或膠原酶消化成單細(xì)胞。 3.細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后用0.25﹪胰酶-0.04﹪EDTA消化，1：3～4傳代。 4.液氮罐口懸掛方法冷凍大量傳代細(xì)胞。 [結(jié)果]：

5、 1.建立了10株包皮細(xì)胞系。 2.建立了子宮內(nèi)膜、胎兒皮膚、胎兒肌肉細(xì)胞系各2株。 3.培養(yǎng)了輸卵管、流產(chǎn)胎兒的絨毛、胎鼠成纖維細(xì)胞系各一株。 4.凍存了大量傳代細(xì)胞以備接種胚胎干細(xì)胞。 第2部分 各種飼養(yǎng)層對(duì)人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)支持情況的比較 [目的]： 1.摸索適合人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的不同飼養(yǎng)層條件。 2.比較人胚胎干細(xì)胞在不同飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)情況。 3.檢測(cè)不同飼養(yǎng)

6、層細(xì)胞分泌的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。 [方法]： 1.從絲裂霉素作用時(shí)間、細(xì)胞密度等方面，尋找不同飼養(yǎng)層適合人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳狀態(tài)。 2.在各種飼養(yǎng)層上同期接種同一株人胚胎干細(xì)胞，比較它們的生長(zhǎng)特點(diǎn)。 3.ELISA方法檢測(cè)各種人源飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的bFGF。 [結(jié)果]： 1.所試用各種飼養(yǎng)層在一定程度上均可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)，傳代超過(guò)10代，以包皮和輸卵管來(lái)源的飼養(yǎng)層為最

7、佳。 2.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，飼養(yǎng)層從優(yōu)到劣依次為：包皮、子宮內(nèi)膜、絨毛、輸卵管、胎皮、胎肌；根據(jù)胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，飼養(yǎng)層排序?yàn)椋喊?、輸卵管、子宮內(nèi)膜、絨毛、胎肌、胎皮。 3.SPSS統(tǒng)計(jì)分析：輸卵管細(xì)胞分泌的bFGF與其它組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，包皮、絨毛、胎肌之間無(wú)差異(p>0.05)與子宮內(nèi)膜、胎皮有差異(p<0.05)；子宮內(nèi)膜、胎皮、無(wú)差異(p>0.05) 。 第3部分 包皮飼養(yǎng)層上人胚胎干

8、細(xì)胞的建系和鑒定 [目的]： 1.在包皮來(lái)源的飼養(yǎng)層上建立人胚胎干細(xì)胞系。 2.鑒定新建的細(xì)胞系是否符合胚胎干細(xì)胞的建系標(biāo)準(zhǔn)。 [方法]： 1.收集不適合移植和冷凍的廢棄胚胎，培養(yǎng)到囊胚階段。 2.機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，接種到包皮飼養(yǎng)層上。7天內(nèi)首次傳代，以后每4～6天傳代一次。 3.鑒定新建立的人胚胎干細(xì)胞系。 3.1分析核型并檢測(cè)堿性磷酸酶活性。 3.2用免疫熒光

9、方法檢測(cè)下列分子標(biāo)記：SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81和CD9，CD90。 3.3利用RT-PCR檢測(cè)未分化細(xì)胞Oct-4及分化細(xì)胞三胚層相關(guān)基因的表達(dá)。 3.4將未分化細(xì)胞注射入免疫缺陷的SCID小鼠后腿肌肉，觀(guān)察是否形成畸胎瘤，檢測(cè)胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)分化潛能。 [結(jié)果]： 1.在包皮來(lái)源的飼養(yǎng)層上建立了一株人胚胎干細(xì)胞系。 2.核型正常，為46XX.；

10、堿性磷酸酶活性較強(qiáng)。 3.細(xì)胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4和腫瘤相關(guān)抗原TRA-1-60、TRA-1-81陽(yáng)性；SSEA-1、CD9、CD90陰性。 4.未分化細(xì)胞表達(dá)Oct-4，分化細(xì)胞表達(dá)三胚層基因GAPDH，NF-68(外胚層)；α-Cardiac actin，β-actin(中胚層)；α-feto、Glu-2(內(nèi)胚層)。 5.時(shí)間尚短，畸胎瘤暫未形成，該實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中，體內(nèi)分化有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

11、 [結(jié)論]： 1.所用不同組織來(lái)源的細(xì)胞，在傳代2、3次后形態(tài)均呈纖維狀，但生長(zhǎng)特性、老化進(jìn)程不同。 2.所試用各種飼養(yǎng)層在一定程度上均可支持人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)，傳代超過(guò)10代，以包皮和輸卵管來(lái)源的飼養(yǎng)層為最佳。 3.人胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)及分化情況和飼養(yǎng)層細(xì)胞密度有關(guān)。 4.輸卵管分泌bFGF量最高，與其它組織之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01=)。包皮、絨毛、胎肌之間無(wú)差異(p>0.05)；包皮、絨毛、