不同飼養(yǎng)層對牛胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響.pdf

1、雖然圍繞牛胚胎干細(xì)胞建系已進(jìn)行了大量的研究，但迄今為止仍未建立適合牛胚胎干細(xì)胞的環(huán)境條件。探索一種適合其生長的飼養(yǎng)層保持未分化狀態(tài)，對保證干細(xì)胞的全能性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同飼養(yǎng)層培養(yǎng)的牛胚胎干細(xì)胞，采用形態(tài)學(xué)鑒定、免疫熒光染色、堿性磷酸酶染色、擬胚體形成OCT4、SOX2、NANOG的RT-PCR檢測等方法對牛胚胎干細(xì)胞進(jìn)行檢測；進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測以小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的不同代次牛胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因O

2、CT4、SOX2、NANOG表達(dá)差異，并與兩種飼養(yǎng)層培養(yǎng)的同一代次牛胚胎干細(xì)胞多潛能特征基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)量進(jìn)行了比較，以求探索一種新的更適合牛胚胎干細(xì)胞生長的飼養(yǎng)層，為最終建立牛胚胎干細(xì)胞系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.首次采用以小鼠胎兒成纖維細(xì)胞和同源的牛胎兒成纖維細(xì)胞按一定比例(5種)制成的混合飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛胚胎干細(xì)胞。結(jié)果顯示生長在混合飼養(yǎng)層上的牛胚胎干細(xì)胞比單獨(dú)生長在小鼠或牛胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的結(jié)構(gòu)致

3、密、與滋養(yǎng)層界限明顯；小鼠和牛胎兒成纖維細(xì)胞在1:1比例混合飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下牛胚胎干細(xì)胞克隆結(jié)構(gòu)致密、顯著堆積且邊緣輪廓清晰，優(yōu)于其它比例組合；獲得的牛胚胎干細(xì)胞AKP染色及OCT-4、SSEA-1抗原表達(dá)均成陽性，分別在體外分化培養(yǎng)形成了擬胚體。結(jié)果表明小鼠和牛胎兒成纖維細(xì)胞在以1:1比例混合下制成的飼養(yǎng)層能更好的支持牛胚胎干細(xì)胞的體外生長，得到的克隆形態(tài)最好。
　　 2.采用國產(chǎn)絲裂霉素處理不同濃度的SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫

4、代鳥嘌呤和耐鳥苯苷亞系(STO細(xì)胞)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛胚胎干細(xì)胞，為牛胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。用10、15、20、30、40μg/mL國產(chǎn)絲裂霉素分別處理1.5、3、4h的STO細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增加形態(tài)學(xué)觀察STO細(xì)胞生長變化，并對生長在以STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的牛胚胎干細(xì)胞進(jìn)行OCT-4和SSEA-4免疫組化檢測、堿性磷酸酶染色、體外分化形成擬胚體等實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示當(dāng)絲裂霉素的濃度為15μg/mL處理3h可有效的抑制細(xì)胞分

5、裂；STO細(xì)胞在5-10代作為飼養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)最好且獲得的牛胚胎干細(xì)胞AKP染色及OCT4、SSEA-4抗原表達(dá)均成陽性，且在體外培養(yǎng)可形成擬胚體。結(jié)果證明使用國產(chǎn)絲裂霉素能有效的處理STO細(xì)胞且在以STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的牛胚胎干細(xì)胞能很好的保持其未分化狀態(tài)。
　　 3.檢測牛胚胎干細(xì)胞的多潛能特征基因-OCT-4、SOX2、NANOG表達(dá)情況，以此找到影響牛胚胎干細(xì)胞生長的主要原因。通過RT-qPCR檢測以MEF為飼養(yǎng)層生長

6、的第1代到第5代牛胚胎干細(xì)胞多潛能特征基因和相關(guān)因子表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長在以MEF作為飼養(yǎng)層上的牛胚胎干細(xì)胞隨著傳代的增加OCT-4、SOX2、NANOG三者表達(dá)量明顯減少，導(dǎo)致牛胚胎干細(xì)胞自身維持多能性能力降低且促進(jìn)相關(guān)分化基因的表達(dá)，這是以MEF作為飼養(yǎng)層培牛胚胎干細(xì)胞無法持續(xù)傳代的根本原因。以兩種新的飼養(yǎng)層即牛和小鼠胎兒成纖維混合飼養(yǎng)層和STO細(xì)胞培養(yǎng)的第五代牛胚胎干細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR檢測多潛能特征基因和相關(guān)因子表達(dá)。結(jié)果表