卵黃免疫球蛋白親和配基分離蛇毒Gln49-PLA-,2-的研究.pdf

1、免疫親和層析是一種非常有效的生物大分子純化方法,特別是應(yīng)用在純化過程的第一步.該論文根據(jù)卵黃免疫球蛋白(IgY)產(chǎn)量大、易于分離等特點,將其作為免疫親和配基分離相應(yīng)抗原.選用長白山白眉蝮蛇蛇毒中的Gln49磷脂酶A<,2>(Gln49-PLA<,2>)為抗原免疫產(chǎn)蛋雞,收集雞蛋,以天數(shù)和ELISA數(shù)值(OD值表示IgY相對活性)為坐標(biāo)繪制免疫滴定曲線,結(jié)果表明三次加強免疫后可持續(xù)獲得抗體,在免疫后51天相對活性達到最高(0.654),一

2、年后抗體的相對活性維持在0.614,證明特異性抗體的含量至少在一年內(nèi)基本不變.幾種PEG6000沉淀法粗分IgY的結(jié)果顯示卵黃液采用PEG6000-乙醇沉淀法,得到的IgY純度最高,特異活性強,卵磷脂去除較徹底,利于長期保存;用偶聯(lián)Gln49-PLA<,2>的Sepharose 4 Fast Flow的親和介質(zhì)從卵黃液中一步分離得到特異性抗體,抗體活性提高39倍;以抗Gln49-PLA<,2>-Sepharose 4 Fast Flow

3、的特異性IgY重復(fù)上樣,收集相應(yīng)組分,根據(jù)Langmuir-type吸附等溫曲線,測定免疫親和介質(zhì)的最大載量q<,m>為0.59mg/mlgel,解離常數(shù)K<,d>為4.4×10<'-5>mg/ml;Western-blot顯示抗原與抗體特異性結(jié)合.以抗Gln49-PLA<,2>特異性IgY為配基偶聯(lián)到溴化氰活化的Sepharose 4 Fast Flow介質(zhì)上,一步分離長白山白眉蝮蛇粗毒中的Gln49-PLA<,2>,所得目的蛋白純度

4、高達95%,回收率大于83%,產(chǎn)率約為13%,與實驗室四步分離Gln49-PLA<,2>相比,步驟簡單,產(chǎn)率提高6.5倍;Anti-Gln49-PLA<,2>-IgY-Sepharose 4 Fast Flow親和介質(zhì)的最大載量q<,m>為0.49mg/ml gel,解離常數(shù)K<,d>為1.66×10<'-7>mg/ml,表明以anti-Gln49-PLA<,2>特異性IgY為配基時不需要苛刻的洗脫條件,是比較理想的生物親和配基;配基使