口服微囊化卵黃免疫球蛋白（IgY）的制備及性能研究.pdf

1、口服特異性卵黃免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin，IgY)可治療由細(xì)菌或病毒引起的腸道疾病，具有安全無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗藥性、服用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的抗生素替代品。但I(xiàn)gY在高強(qiáng)度的胃酸環(huán)境中易被胃蛋白酶降解，失去抗體活性。因此，如何避免IgY在胃中失活，而在小腸中穩(wěn)定地發(fā)揮作用，是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。針對(duì)這一問(wèn)題，本論文采用微囊化技術(shù)包埋IgY，制備口服型IgY-殼聚糖-海藻酸鈉微囊，從體外、體內(nèi)兩

2、方面評(píng)價(jià)殼聚糖.海藻酸鈉微囊作為IgY口服載體的可行性。 本研究以引起仔豬腹瀉的最主要致病菌--產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88為抗原，免疫蛋雞后獲得特異性IgY。通過(guò)對(duì)獲得高效價(jià)特異性IgY的最佳抗原濃度研究發(fā)現(xiàn)，K88菌毛蛋白對(duì)蛋雞的免疫原性優(yōu)于全菌；純化的菌毛蛋白對(duì)蛋雞的免疫原性優(yōu)于粗菌毛蛋白，其誘導(dǎo)的抗體效價(jià)最高可達(dá)1:480000；確定菌毛蛋白的最佳濃度為2 mg/ml，全菌的最佳濃度為1010 mg/ml。 通過(guò)對(duì)

3、IgY的分離純化條件研究發(fā)現(xiàn)，鹽析法提取IgY的最佳條件是將粗提的IgY經(jīng)50％飽和度的硫酸銨鹽析一次，再經(jīng)14％(w/v)硫酸鈉鹽析一次，獲得的IgY回收率可達(dá)46％，純度可達(dá)77％；經(jīng)超濾(100 kDa)后，最終獲得的IgY凍干粉純度為82％。 對(duì)IgY穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，溫度不超過(guò)70℃時(shí)，IgY具有良好的熱穩(wěn)定性；pH<3時(shí)，IgY活性大部分喪失：IgY對(duì)胰蛋白酶有較好的抵抗力，但低pH條件下對(duì)胃蛋白酶十分敏感；冷

4、凍干燥處理對(duì)IgY活性有不利的影響；-20℃和4℃環(huán)境中，IgY凍干粉具有良好的貯藏穩(wěn)定性。 為保護(hù)IgY的口服活性，選用天然材料海藻酸鈉和殼聚糖作為壁材，利用氣體吹噴制囊法，制備IgY-殼聚糖.海藻酸鈉微囊?？疾炝顺赡已b置主要的物理?xiàng)l件對(duì)空白殼聚糖.海藻酸鈉微囊粒徑及形態(tài)的影響，確定制備微囊的最佳物理?xiàng)l件為：空氣壓力0.3 m3/h，液面距8 cm，恒流泵速度4 ml/min，攪拌子轉(zhuǎn)速200 r/min。此條件下制備的新鮮

5、微囊球形圓整，平均粒徑約1 mm，且粒徑分布集中。在此基礎(chǔ)上，探討了主要反應(yīng)條件對(duì)微囊的載藥量、包封率、保護(hù)IgY在模擬胃液中的穩(wěn)定性、以及微囊在體外的釋放行為的影響。確定制備微囊的優(yōu)化條件為：成囊溶液pH 3.5，殼聚糖濃度0.2％(w/v)，CaCl2濃度0.5％(w/v)，海藻酸鈉濃度2％(w/v)，藥載比25％，在此優(yōu)化條件下制備的IgY微囊載藥量高于20％，包封率高于75％，IgY在模擬胃液中2 h累積釋放率小于lO％，而在模

6、擬腸液中4 h累積釋放率大于80％。另外，ELISA和SDS-PAGE結(jié)果顯示，IgY微囊在模擬胃液中可抵抗胃蛋白酶的降解，而且抗體的活性保持在70％以上。 將IgY-殼聚糖.海藻酸鈉微囊用于斷奶仔豬的攻毒治療試驗(yàn)，結(jié)果表明，腹瀉斷奶仔豬服用IgY微囊后，病情很快得到控制，1 d后所有病豬得到治愈，而且體重增加最快；而未包埋的IgY凍干粉治療效果低于微囊化IgY，3 d后所有病豬得到治愈。而對(duì)照組仔豬口服生理鹽水，第1 d有腹