雞卵黃免疫球蛋白的分離純化、mPEG修飾及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、雞卵黃免疫球蛋白，簡(jiǎn)稱IgY(chicken eggyolk immunoglobulin)，又稱雞卵黃抗體，是由血液中IgG被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中唯一的免疫球蛋白類。由于IgY是蛋白質(zhì)類大分子，具有一定的免疫原性，當(dāng)其用于機(jī)體時(shí)，會(huì)引發(fā)抗體產(chǎn)生而降低療效，并且易受溫度、酸堿、酶的影響，從而限制了IgY的應(yīng)用領(lǐng)域。本文針對(duì)這一問題，制備了mPEG化IgY，主要研究?jī)?nèi)容為：雞IgY分離純化，mPEG化學(xué)修飾，以及修飾前后的IgY穩(wěn)定性進(jìn)行

2、對(duì)比研究。研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了一種高效、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模分離純化雞卵黃免疫球蛋白(IgY)的生產(chǎn)方法，即在對(duì)傳統(tǒng)水稀釋法改良的基礎(chǔ)上，結(jié)合聚乙二醇沉淀與離子交換色譜進(jìn)行IgY的分離純化。具體工藝為新鮮雞蛋經(jīng)過分離得到蛋黃液，經(jīng)水稀釋后，離心得上清液，向上清液中加入PEG6000沉淀蛋白，沉淀物經(jīng)透析、冷凍干燥之后經(jīng)過一步離子交換法進(jìn)行純化，并對(duì)具體工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用8倍無菌水稀釋蛋黃液，用0.1 mol

3、/L HCl調(diào)節(jié)pH為5.2，在4℃下靜置8h，于5000×g力離心可得上清粗IgY，經(jīng)測(cè)定回收率可達(dá)93.47%。然后用6%聚乙二醇沉淀后經(jīng)DEAE-Toyopearl650 M離子交換純化，最佳的純化條件：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7)平衡上樣，0.075 mol/L PBS(pH7)洗脫。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析結(jié)果顯示所得的IgY的純度為95%，活性保持率高達(dá)73.77%。本

4、研究彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分離方法不能同時(shí)達(dá)到高純度和高回收率的缺點(diǎn)，且可用于大規(guī)模生產(chǎn)。
　　 2.研究了單甲氧基聚乙二醇(mPEG)對(duì)雞卵黃免疫球蛋白(IgY)的化學(xué)修飾，并通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜和熒光光譜分析比較了修飾前后IgY的穩(wěn)定性。具體修飾方法為：mPEG經(jīng)NHS活化，得NHS-mPEG，冷凍干燥，NHS-mPEG對(duì)IgY進(jìn)行化學(xué)修飾，得mPEG-IgY。mPEG對(duì)IgY進(jìn)行修飾過程中，通過對(duì)各種修飾條件的摸索和比較

5、優(yōu)化，最后篩選出mPEG最佳修飾反應(yīng)條件為：IgY與活化后的mPEG按摩爾比1:10，pH7條件下反應(yīng)1h可得修飾率為20.56%的mPEG-IgY，IgY活性保持率可達(dá)90%。修飾前的IgY二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random分別為14.5%、42.1%、6.2%、37.2%；修飾后的mPEG-IgY各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分別為9.1%、44.9%、7.4%、38.6%。與修飾前相比，mPEG-IgY的α-螺旋

6、含量降低了約37%，β-螺旋含量升高，其他含量變化不明顯。
　　 3.通過光譜分析法對(duì)IgY以及mPEG-IgY的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，70℃溫育120min后，IgY的α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由14.5%、42.1%、6.2%、37.2%變?yōu)?.6%、55.25%、5.8%、37.5%；mPEG-IgY的各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由12.9%、42.7%、6.3%、38.1%變?yōu)?.

7、1%、50.5%、7.2%、39.2%。熱動(dòng)力學(xué)分析表明，IgY熱變性反應(yīng)級(jí)數(shù)為1級(jí)，在65、70、75、80、85、90℃加熱條件下，D值分別為：166.67、37.59、6.48、2.92、1.79、1.13 min；此溫度范圍內(nèi)的Z值為11.5℃，表觀活化能Ea=200.841 kj/mol，焓值分別為198.0296、197.988、197.9465、197.9049、197.8633、197.8218 kJ/mol，熵值分別為

8、58.66751、58.65283、58.63837、58.62411、58.59619 kJ/(mol·K)，吉普斯自由能分別為33.09298、30.65444、28.2166、25.77931、23.34261、20.90646 kJ/mol。mPEG-IgY熱變性反應(yīng)級(jí)數(shù)為1級(jí)，在65、70、75、80、85、90℃加熱條件下，D值分別為：208.33、60.61、8.02、4.48、2.50、2.18min；此溫度范圍內(nèi)的Z值

9、為12.22℃，表觀活化能Ea=186.915 kJ/mol，焓值分別為84.1036、184.0621、184.0205、183.9789、183.9373、183.5958 kJ/mol，熵值分別為53.50651、53.49183、53.47737、53.62411、58.61005、58.59619 kJ/(mol·K)，吉普斯自由能分別為33.67654、31.45257、29.2292、27.00644、24.78425、2

10、2.26271 kJ/mol。
　　 4.對(duì)IgY以及mPEG-IgY不同酸堿條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在4h、pH11條件下mPEG-IgY活性保持率比IgY活性保持率高接近五倍。圓二色光譜掃描分析顯示，在pH4處理?xiàng)l件下，IgY的α螺旋含量降低了76.4%，而修飾后的IgY降幅減少15.7%；IgY以及mPEG-IgY的p折疊含量均有所增高，增幅分別為18.4%和29.7%。在pH11條件下圓二色光譜掃描結(jié)果為Ig

11、Y的α螺旋含量降低了71.1%，而修飾后的IgY降幅減少14.9%；IgY以及mPEG-IgY的β折疊含量均有所增高，增幅分別為16.5%和21.7%。說明IgY經(jīng)過mPEG修飾以后所得產(chǎn)物對(duì)酸堿有著更高的耐受力。
　　 5.對(duì)IgY以及mPEG-IgY在模擬胃腸液消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在pH4的模擬胃液消化過程中，反應(yīng)30～45 min時(shí)間段內(nèi)，IgY活性保持率由83.57%變?yōu)?5.59%，活性降低28.0

12、8%；mPEG-IgY活性保持率由89.81%變?yōu)?2.63%，活性降低17.18%。反應(yīng)90～120 min時(shí)間段內(nèi)，IgY活性保持率由46.24%變?yōu)?1.33%，活性降低14.91%；mPEG-IgY活性保持率由63.21%變?yōu)?0.44%，活性降低2.77%。pH2條件下，對(duì)比IgY以及mPEG-IgY活性保持率可以發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)30～45 min時(shí)間段內(nèi)，IgY活性保持率由71.69%變?yōu)?0.37%，活性降低21.32%；mPE

13、G-IgY活性保持率由83.33%變?yōu)?5.25%，活性降低18.08%。反應(yīng)90～120 min時(shí)間段內(nèi)，IgY活性保持率由41.36%變?yōu)?0.69%，活性降低20.67%；mPEG-IgY活性保持率由55.49%變?yōu)?9.82%，活性降低5.67%。氨基酸成分分析結(jié)果顯示，修飾前以及修飾后的IgY，氨基酸成分以及含量基本一致，說明IgY在經(jīng)過mPEG修飾之后一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有被破壞。寡肽成分分析結(jié)果表明，經(jīng)消化液酶解后，mPEG-Ig