蛇毒Gln49-PLA-,2-及突變體可溶表達(dá)與純化.pdf

1、本課題組從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Gloydius ussurensis)毒素中分離得到磷脂酶A2的同源物，質(zhì)譜檢測(cè)分子量為13880.789kDa，等電聚焦測(cè)定其pI值約為8.56，并將其命名為Gln49-磷脂酶A2(簡(jiǎn)稱GIn49-PLA2)。GIn49-PLA2具有神經(jīng)毒性、肌肉毒性、細(xì)胞毒性和絲氨酸蛋白酶的類凝血酶活性，但檢測(cè)不到水解磷脂酰膽堿的催化活性；該酶含有14個(gè)Cys殘基，能夠形成七對(duì)二硫鍵，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能良好的素材。通

2、過基因亞克隆和PCR定點(diǎn)突變，使得GIn49-PLA2及其突變體Lys49-PLA2、Asp49-PLA2基因在pET-32a(+)載體上以包涵體形式進(jìn)行融合表達(dá)，但是結(jié)果并不理想。本論文工作的目的是通過基因亞克隆和PCR定點(diǎn)突變的手段，在pMALc2x載體上實(shí)現(xiàn)PLA2及其多個(gè)突變體基因的可溶高效表達(dá)。 利用PCR技術(shù)亞克隆GIn49-PLA2基因，采用重疊延伸PCK技術(shù)定點(diǎn)突變獲得突變體Asp49-PLA2、Lys49-PL

3、A2等基因，構(gòu)建pMAL-Asp49-PLA2、pMAL-Lys49-PLA2重組融合表達(dá)質(zhì)粒；將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，雙酶切后電泳檢測(cè)，對(duì)重組DNA測(cè)序，獲得陽性克隆。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1中，通過SDS-PAGE對(duì)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的蛋白檢測(cè)，驗(yàn)證了fmAsp-PLA2確實(shí)以可溶形式表達(dá)。通過對(duì)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，確定了TB1在37℃，培養(yǎng)到OD600約為0.4時(shí)，加入終濃度為0.5mMIPTG，誘導(dǎo)4h，可獲得高效

4、可溶表達(dá)的融合蛋白。隨后，采用一步親和層析、陰離子交換層析從細(xì)胞裂解液中獲得純度較高的fmAsp49-PLA2；用蛋白水解酶Factor Xa體外切除融合標(biāo)簽MBP，電泳結(jié)果顯示酶切后產(chǎn)生大約40kDa和14kDa的兩部分蛋白，證明融合蛋白表達(dá)正確；優(yōu)化的酶切條件為：溫度，4℃；fmAsp49-PLA2濃度，0。8mg蛋白/ml；酶切時(shí)間，12h。酶切后采用陽離子交換層析、肝素層析和凝膠層析仍然無法將目的蛋白與融合標(biāo)簽分離。對(duì)fmAsp