山茱萸環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)糖尿病腎病的作用及作用機(jī)理分析.pdf

1、第一部分環(huán)烯醚萜總苷對(duì)糖尿病腎病大鼠的作用及作用機(jī)理分析 一、環(huán)烯醚萜總苷對(duì)糖尿病腎病大鼠體重、飲水量、進(jìn)食量及血糖的影響 二、環(huán)烯醚萜總苷對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟等組織的保護(hù)作用 三、環(huán)烯醚萜總苷延緩糖尿病腎病大鼠的作用機(jī)理分析 (一)對(duì)血清糖基化終產(chǎn)物-肽(AGE-P)水平的影響 目的 探討環(huán)烯醚萜總苷對(duì)糖尿病腎病大鼠血清糖基化終產(chǎn)物-肽(AGE-P)水平

2、的影響。方法在正常進(jìn)食條件下，大鼠先以30mg.kg<'-1> ip.STZ溶液，第二天再按0.11ml/只ip.FCA，每周1次，連續(xù)3周。3周后測(cè)定大鼠血糖，若血糖1≥6.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值范圍隨機(jī)分為模型組、氨基胍組(O.1g.kg<'-1>)和環(huán)烯醚萜總苷組(0.25、0.5g.kg<'-1>)，同期另設(shè)一正常組，各組連續(xù)ig.12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，運(yùn)用流動(dòng)注射分析法(flow injection assay，

3、FIA)檢測(cè)不同組別血清中的AGE-P含量。結(jié)果模型組血清AGE-P 水平顯著增加(14.3±4.3 vs 2.8±0.4，P＜0.01)，而環(huán)烯醚萜總苷及氨基胍均能降低血清AGE-P水平，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論環(huán)烯醚萜總苷能降低糖尿病腎病大鼠血清 AGE-P 水平，具有抑制蛋白非酶糖基化作用。 (二)對(duì)腎臟和坐骨神經(jīng)Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性的影響 目的 觀察環(huán)烯

4、醚萜總苷對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟和坐骨神經(jīng)Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性的作用。方法在正常進(jìn)食條件下，大鼠先以30mg.kg<'-l> ip.STZ 溶液，第二天再按0.11ml/只ip.FCA，每周1次，連續(xù)3周。3周后測(cè)定大鼠血糖，若血糖≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值范圍隨機(jī)分為模型組、氨山茱萸環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)糖尿病腎病的作用及作用機(jī)理分析基胍組(0.1g.kg<'-1>)和環(huán)烯醚萜總苷組(0.25、0

5、.5g.kg<'-1>)，同期另設(shè)一正常組，各組連續(xù)ig.12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用ATP酶試劑盒及考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測(cè)定糖尿病大鼠腎組織細(xì)胞膜和坐骨神經(jīng)Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性的改變。結(jié)果模型組Na<'+>,K<'+>-ATP酶活性明顯降低(0.894±0.03vs0.964±0.02，P<0.01，腎；0.889±0.03vs 0.960±0.02，P<0.01，坐骨神經(jīng))，而環(huán)烯醚萜總苷Ⅱ組能顯著改善Na<'+>，k<

6、'+>-ATP酶活性(0.928±0.2 vs0.894±0.03，P<0.05，腎；0.931±0.02 w 0.889±0.03，P<0.05，坐骨神經(jīng))，具有良好的修復(fù)作用。結(jié)論從環(huán)烯醚萜總苷可修復(fù)糖尿病大鼠腎組織Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性，我們推斷其可能通過(guò)多元醇通路防治糖尿病腎病。 (三)對(duì)血清超氧化物歧化酶SOD水平的影響 目的 通過(guò)對(duì)大鼠血清SOD水平的變化，從氧化應(yīng)激角度探討環(huán)烯醚

7、萜總苷對(duì)糖尿病腎病的作用。方法 在正常進(jìn)食條件下，每只大鼠先以30mg／kg ip．STZ溶液，第二天再按0.11ml／只ip．FCA，每周1次，連續(xù)3周。3周后測(cè)定大鼠血糖，若血糖≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值范圍隨機(jī)分為模型組、氨基胍組(0.1g.kg<'-1>)和環(huán)烯醚萜總苷組(0.25、0.5g.kg<'-1>)，同期另設(shè)一正常組，各組連續(xù)ig.12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清SOD含量。結(jié)果造模12

8、周后，糖尿病腎病模型大鼠血清SOD值較正常組顯著降低(38.0±3.8vs49.5±4.1，P<0.01)，而環(huán)烯醚萜總苷Ⅰ、Ⅱ均能顯著增加SOD的含量，與模型組比較有顯著性差異(43.0±4.3 vs38.0±3.8，P<0.05；47.2±3.7 vs38.0±3.8，P<0.01)。結(jié)論環(huán)烯醚萜總苷可能通過(guò)抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)防治糖尿病腎病。 第二部分環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)高糖及AGEs致腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及

9、作用機(jī)理分析 一、高糖和AGEs對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)增殖的影響 二、環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)高糖和AGEs致RMC增殖的抑制作用 三、 環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)高糖和 AGEs 致 RMC 增殖抑制作用的機(jī)理分析 (一)對(duì)高糖和AGEs 致 RMC Na<'+>，K<'+>-ATP酶活性的影響 目的 研究環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)高糖和AGEs致RMC Na<'+>，K<'+>-ATP

10、酶活性的影響。方法用含高糖、AGEs 的 5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液配制莫諾苷、馬錢子苷、環(huán)烯醚萜總苷、氨基胍和黃芪注射液，使葡萄糖終濃度為30mM，AGEs終濃度為0.25mg/ml，藥物終濃度為1×10<'-4>M(1×10<'-2> g.L<'-1>)。同時(shí)設(shè)5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液、含30mM葡萄糖的5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液和含O.25mg/mlAGEs 的 5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液作對(duì)照。

11、將0.25％胰酶消化、吹打均勻的RMC接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃、5％CO<,2> 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，血清饑餓24h，使細(xì)胞同步，后各組加藥，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)細(xì)胞消化、離心、棄上清，留下層細(xì)胞，用生理鹽水制備成10<'7>/mm<'3>的懸液，再用超聲粉碎器進(jìn)行破碎。制備好的細(xì)胞懸液不需要離心，在測(cè)試加樣前要搖勻后取樣。然后按照試劑盒的要求先測(cè)試細(xì)胞蛋白含量，再進(jìn)行Na<'+>，K<'+>-ATP 酶測(cè)定。結(jié)果

12、高糖和AGEs顯著降低Na<'+>，K<'+>-ATP 酶活性(0.059±0.021vs0.126±0.046，P＜0.05，高糖)；(0.057±0.020 vs0.126±0.046，P＜0.05,AGEs)，而莫諾苷、馬錢子苷和環(huán)烯醚萜總苷均能提高其活性，與高糖和AGEs組相比差異顯著。結(jié)論環(huán)烯醚萜總苷及有效成能充分修復(fù)高糖和AGEs對(duì)RMCNa<'+>，K<'+>-ATP 酶的損傷。 (二)對(duì)AGEs致RMC氧化應(yīng)激的

13、影響 目的 研究環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)AGEs致 RMC 氧化應(yīng)激的影響。方法 用含AGEs的5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液配制莫諾苷、馬錢子苷、環(huán)烯醚萜總苷、氨基胍和黃芪注射液，使AGEs終濃度為0.25mg/ml，藥物終濃度為1×10<'-4>M (1×10<'-2>gL<'-1>)。同時(shí)設(shè)5％FBSRPMI-1640 培養(yǎng)液和含0.25mg／mlAGEs 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷及有效成分對(duì)糖尿病腎病的作用及作用

14、機(jī)理分析的5％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液作對(duì)照。在37℃、5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，取細(xì)胞上清液測(cè)定SOD、MDA和GSH-PX。將DCFH-DA配制成20μmol／L濃度的工作液，將各組RMC用0.25％胰酶消化，吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，再用PBS洗滌2次，最后一次洗滌棄去PBS液，加入200μl工作液在37℃下孵育30min，再用PBS洗滌2次，吹打均勻，用400目尼龍膜過(guò)濾為單個(gè)細(xì)胞，上

15、機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量。流式細(xì)胞儀參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。結(jié)果0.25mg／mlAGEs上調(diào)ROS、MDA(1293.28±72.69 vs287.15±17.18,P<0.001 ROS，4.46±0.95vs2.97±0.48，P<0.01 MDA)，下調(diào)SOD、GSH-PX(14.78±1.69 vs30.84±3.18，P<0.001 SOD，62.75