TIPE2通過上調(diào)caspase下調(diào)NF-κB促進(jìn)佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維樣細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:TIPE2能夠抑制炎癥以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且TIPE2過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種免疫多態(tài)性慢性疾病，我們應(yīng)用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes of ratadjuvant arthritis，AA-FLS)，通過體外實(shí)驗(yàn)分析TIPE2對(duì)死亡受體5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用探討TIPE2對(duì)佐劑型關(guān)節(jié)炎發(fā)病的影響。
　　方法:通過RT-PCR、

2、熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blotting技術(shù)檢測(cè)正常大鼠滑膜成纖維樣細(xì)胞以及AA-FLS中TIPE2的表達(dá)，明確TIPE2在兩種細(xì)胞系的表達(dá)情況。進(jìn)一步應(yīng)用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AA-FLS，提高TIPE2在AA-FLS的表達(dá)并應(yīng)用熒光顯微鏡、RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blotting技術(shù)進(jìn)行鑒定。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用抗DR5單鏈抗體ZF1研究TIPE2對(duì)AA-FLS細(xì)胞增殖及凋亡的影響，W

3、estern-blotting，caspase8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，并用caspase抑制劑Z-VAD-FMK以及NF-κB抑制劑Bay同步干擾試驗(yàn)組，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡，研究TIPE2調(diào)控的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:通過RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TIPE2在正常大鼠滑膜成纖維樣細(xì)胞表達(dá)，在AA-FLS中表達(dá)明顯降低。通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得TIPE2過表達(dá)

4、穩(wěn)定細(xì)胞株TIPE2+/+-FLS以及相應(yīng)的空載組細(xì)胞株MIGR1-FLS。在TIPE2+/+-FLS穩(wěn)定細(xì)胞株中，TIPE2基因水平及蛋白水平的表達(dá)都顯著上調(diào)，TIPE家族其他成員如TIPE1，TIPE3的表達(dá)量沒有改變。ZF1刺激后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞凋亡率及DR5的表達(dá)量以及caspase8的活化量在TIPE2+/+-FLS均有明顯的增加，與MIGR1-FLS組相比，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且TIPE2+/+-FLS磷酸化的

5、NF-κB和磷酸化的AKT明顯下調(diào)，與MIGR1-FLS組相比，差異顯著。在ZF1處理前60min，TIPE2+/+-FLS組給予caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理，MIGR1-FLS組給予NF-κB抑制劑Bay預(yù)處理，結(jié)果提示caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理的TIPE2+/+-FLS組凋亡率明顯降低，其凋亡率與MIGR1-FLS組相當(dāng);NF-κB抑制劑Bay預(yù)處理的MIGR1-FLS組凋亡率明顯提高。