血清中嗜肝DNA病毒共價閉合環(huán)狀DNA動態(tài)檢測的實驗和臨床研究.pdf

1、本研究以實驗室建立的一套特異、靈敏的HBV cccDNA檢測技術為基礎，分別以不同程度肝損傷的DHBV感染上海麻鴨和乙型肝炎患者為研究對象，探討在外周血中檢測cccDNA的可能性及相關的影響因素。全文共分為三個部分： (一)乙肝病毒與cccDNA在血液中的清除動力學和穩(wěn)定性比較研究；(二)鴨肝損傷模型血清中鴨乙肝病毒cccDNA的動態(tài)檢測；(三)乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的動態(tài)檢測。 第一部分乙肝病毒與cccDNA在

2、血液中的清除動力學和穩(wěn)定性比較研究。 目的：以HBV為對照觀察HBV cccDNA在外周血中的血液動力學特征和穩(wěn)定性，探討在外周血中檢測cccDNA的可行性。 材料與方法： ①將12只1周齡上海麻鴨隨機分為A、B兩組，A組和B組每只鴨分別以1.2×10<'9>copies/ml的HBV攜帶者血清和含1.2×10<'9>copies/ml pBS HBV 3.6 Ⅱ質粒(模擬cccDNA)的人血清1 ml頸靜脈注射

3、。在注射后0.25 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和32 h，分別采靜脈血進行HBV DNA定量檢測。 ②將1.2×10<'8>copies/ml的HBV攜帶者血漿和含有1.2×10<'8>copies/ml的pBS HBV3.6 Ⅱ質粒(模擬cccDNA)人血漿各50μl，分別用5 U的RQ1 DNase酶處理37℃1 h，并以未加酶處理的相應血漿為對照，觀察核酸酶處理前后血漿中HBV DNA的變化。

4、 ③將1.2×10<'8>copies/ml的HBV攜帶者新鮮血漿和含1.2×10<'8>copies/ml pBS HBV 3.6 Ⅱ質粒(模擬cccDNA)的正常人新鮮血漿各1.5 ml分別置于37℃水浴，在水浴后4h、8h、12h、16h、24h、2d、3d、4d、5d、6d和7d，每管分別取100μl血漿進行HBV DNA定量檢測。 結果： ①HBV和pBS HBV 3.6 Ⅱ質粒在鴨血液中載量的動態(tài)變化均

5、符合單相指數衰減曲線模型。在注射后0.25～24 h內血液中均可檢測到HBV和質粒(cccDNA)，32 h后則未能檢出。HBV和質粒(cccDNA)在鴨血液中的平均半衰期分別為4.536±0.769 h和4.511±0.791 h，二者無統(tǒng)計學差異(P=0.9593)； ②在核酸酶處理前后，血漿中的HBV顆粒無明顯變化，而質粒含量則下降了兩個數量級(log<,10>)。但相同量的HBV顆粒和pBS HBV 3.6 Ⅱ質粒在體外

6、水浴4h～7d，各時點血漿中HBV顆粒和質粒(cccDNA)的量無明顯變化(變異系數分別為1.05％和1.73％)，同一時點血漿HBV和質粒(cccDNA)的量配對t檢驗也無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.8568)。結論HBV cccDNA在血液中的清除動力學特征和穩(wěn)定性均與HBV相似，血清HBV cccDNA檢測在技術上具有可行性。 第二部分鴨肝損傷模型血清中鴨乙肝病毒cccDNA的動態(tài)檢測。 目的：探討在不同程度肝損傷的D

7、HBV感染上海麻鴨外周血中是否能檢測出DHBV cccDNA。 材料與方法： ①建立由一對跨缺口的引物和Taqman熒光探針組成的選擇性DHBV cccDNA熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，用不同濃度的DHBV質粒(cccDNA)和純化DHBV rcDNA驗證該系統(tǒng)區(qū)分cccDNA和rcDNA的效率；并進一步結合PDS(十二烷基硫酸鉀)-蛋白質沉淀法和不降解質粒的ATP依賴DNA酶(PSAD)的酶切法降低模板中的rcDNA背景而

8、實現DHBV cccDNA的特異性擴增。 ②用DHBV強陽性鴨血清注射40只1日齡上海麻鴨，并在注射后2個月選擇持續(xù)感染DHBV的上海麻鴨中的24只隨機分為4組，分別以：A)D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100μg/kg；B)D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl<,4>灌胃2次；C)D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl<,4>灌胃2次，并用生理鹽水處理另一組動物作為正常對照組

9、(NC組)。在處理后不同時間點靜脈抽血1ml，分別檢測血清中的ALT、DHBV載量和DHBV cccDNA，最后處死動物取肝組織評價肝損傷程度，并檢測肝組織中的總DHBV DNA和DHBV cccDNA。 結果： ①選擇性DHBV cccDNA熒光定量PCR檢測系統(tǒng)能擴增10<'3>～10<'8>copies/ml的DHBV質粒(cccDNA)，而以DHBV rcDNA為模板時，只有10<'7>copies/ml以上的D

10、HBVmDNA才會出現弱熒光信號，該系統(tǒng)擴增cccDNA的效率是擴增rcDNA效率的10<'4>倍；PDS-蛋白質沉淀法抽提和PSAD酶切純化可分別使待測樣品中的rcDNA背景降低1個數量級(log<,10>)而保持cccDNA的含量不變，二者與選擇性熒光定量PCR結合檢測10<'8>copies/ml以上的rcDNA均無陽性信號。 ②NC組鴨無明顯病理改變，A組、B組和C組鴨則分別出現點狀壞死至大片肝壞死的肝損傷，3組的肝損傷

11、程度分級具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.000)。B組和c組在實驗結束時分別有1只和4只鴨死亡。NC組和A組各檢測時點血清中均未檢測到DHBV cccDNA；B組和C組在初次CCh處理后12 h分別有2只和3只鴨血清中檢測到DHBVcccDNA，含量在3.17×10<'3>～1.72×10<'4>copies/ml之間，在初次CCl<,4>處理后24 h兩組各有1只鴨血清中仍可以檢測出DHBV cccDNA。Logistic逐步回歸分析顯

12、示血清中DHBV cccDNA的檢出率與肝損傷程度評分有關(P=0.0029)，而與血清DHBV載量、ALT水平以及肝組織中的總HBV DNA和DHBV cccDNA含量無關。 結論： ①由PDS-蛋白質沉淀法抽提、PASD酶切純化和選擇性實時熒光定量PCR組成的DHBV cccDNA檢測方法靈敏度高，特異性好； ②在肝組織發(fā)生嚴重損傷時，血清中可以出現DHBV cccDNA。血清中DHBV cccDNA的出現與

13、肝組織損傷程度有關，而與血清中的ALT水平、血清DHBV載量以及肝組織中總DHBV DNA和cccDNA水平無關。 第三部分乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的動態(tài)檢測。 目的：觀察在不同肝臟病變程度的乙型肝炎外周血中能否檢測HBV cccDNA。 對象與方法：以57例住院的乙型肝炎患者為研究對象，其中輕度慢性乙型肝炎患者(MCHB)26例，重型乙型肝炎(SHB)患者31例。MCHB組每位患者采集血清

14、標本1次共獲得26份血清標本，SHB組每位患者在病程中的不同時間采集血清1～5次共獲得60份血清標本。每份血清標本分別進行HBV載量檢測和HBVcccDNA檢測，并同時記錄各血清標本采集時間點患者的凝血酶原時間(PT)和肝臟生化學指標檢測結果。 結果：①MCHB組有1份血清標本HBV cccDNA為陽性，SHB組有13例患者的13份血清標本HBV cccDNA為陽性，血清HBV cccDNA的含量1.25×10<'3>～4．88

15、×10<'4> copies/ml之間，兩組患者血清HBV cccDNA的檢出率有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.0014)，但血清HBV cccDNA檢測診斷SHB的靈敏度僅為41.94％，準確度僅為66.67％。②Logistic逐步回歸分析顯示，血清HBV cccDNA的檢出率與凝血酶原時間的長短有關(P=0.0072)，而與患者的年齡、性別、血清HBV載量和ALT水平無顯著相關性。 結論：乙型肝炎患者外周血中可以檢測出HBV c