乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究分為兩個(gè)部分：一、乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異檢測方法的建立；二、慢性HBV感染者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的檢測及其與外周血HBV DNA序列的比較。
　　 一、HBV cccDNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異檢測方法的建立
　　 目的：建立HBV cccDNA核苷類似物耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的檢測體系。方法：①設(shè)計(jì)2對(duì)跨雙缺口引物以擴(kuò)增HBV cccDNA、2對(duì)非跨雙缺口引物擴(kuò)

2、增松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，所有引物擴(kuò)增的片段涵蓋拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋常見已知耐藥位點(diǎn)。以梯度稀釋的pBS HBV3.6Ⅱ質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，篩選出聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的最佳退火溫度、Mg2+和二甲基亞砜(DMSO)的濃度、巢式PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)、反應(yīng)條件，了解PCR、巢式PCR的敏感度。②以梯度稀釋的血清HBV DNA為對(duì)照品，了解跨雙缺口引物對(duì)HBV cccDNA和rcDNA的區(qū)分度。③以不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(

3、PSAD)分別消化不同濃度的pBS HBV3.6Ⅱ質(zhì)粒及血清HBV DNA；定量檢測消化前后DNA載量。④以慢性HBV感染者肝移植時(shí)的病肝為標(biāo)本，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-蛋白質(zhì)沉淀法結(jié)合QIAamp柱法DNA提取試劑盒分離提取肝內(nèi)HBV cccDNA和rcDNA，PSAD酶切純化提取產(chǎn)物。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別定量上清和沉淀中的HBV cccDNA和rcDNA，分析消化液加蛋白酶K與否對(duì)提取結(jié)果的影響。⑤以按DNA聚合酶試劑的

4、標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行的單輪PCR(40個(gè)循環(huán))的測序結(jié)果為參照，了解按調(diào)整M廣和DMSO濃度后反應(yīng)體系后的巢式PCR對(duì)測序結(jié)果的影響。結(jié)果：①該體系的最佳Mg2+濃度和DMSO濃度分別為2mM、2％；巢式PCR以第一輪進(jìn)行20循環(huán)后，把產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR反應(yīng)的模板、進(jìn)行38個(gè)循環(huán)反應(yīng)的結(jié)果為佳。②本實(shí)驗(yàn)條件下用該方法，低至103拷貝/ml的cccDNA分子經(jīng)巢式PCR后，其產(chǎn)物量符合測序要求，且5×106拷貝/ml的血清HBV DN

5、A經(jīng)上述反應(yīng)后未見陽性條帶。③血清HBV DNA在PSAD酶切后下降100倍左右，PSAD酶對(duì)cccDNA無明顯酶切效果。④采用SDS-蛋白質(zhì)沉淀法結(jié)合柱法DNA提取試劑盒分離提取肝組織內(nèi)的病毒時(shí)，初次消化不加蛋白酶K并不影響上清中HBV cccDNA的得率；同時(shí)有利于提高沉淀中HBV rcDNA的得率，從而提高沉淀中rc DNA與cccDNA的區(qū)分度。⑤加用了DMSO的巢式PCR并不影響后續(xù)測序結(jié)果的可靠性。結(jié)論：該體系可用于肝細(xì)胞內(nèi)

6、的乙型肝炎病毒cccDNA的核苷類似物耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異檢測，操作方便，特異性高，敏感性較好，測序結(jié)果可靠。
　　 二、慢性HBV感染者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異的檢測及其與外周血HBV DNA序列的比較。
　　 目的：證實(shí)慢性HBV感染者肝組織內(nèi)HBV cccDNA存在核苷類似物耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異，了解肝內(nèi)HBV變異病毒株與血中的異同。方法：①以40例慢性HBV感染的肝移植者術(shù)前的血清、手術(shù)切下非瘤肝組織為標(biāo)本。

7、②以直接煮沸法提取血中HBVDNA，以PCR-直接測序法檢測其基因序列。③采用SDS-蛋白質(zhì)沉淀法結(jié)合柱法DNA提取試劑盒分離提取肝內(nèi)HBV cccDNA和rcDNA，并以PSAD酶酶切純化，對(duì)上清和沉淀中的產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，了解提取效果。以論文第一部分所建的PCR方法分別擴(kuò)增上清中HBV cccDNA和沉淀中HBV rcDNA中的目的基因片段，產(chǎn)物行DNA測序。④對(duì)肝內(nèi)HBV cccDNA、HBV rcDNA和血清中HB

8、V DNA的基因序列對(duì)比分析。結(jié)果：①40例患者中，有21例血清HBV DNA陽性，有31例患者肝內(nèi)HBV cccDNA陽性，有37例患者肝內(nèi)HBV rcDNA陽性，這些病毒陽性標(biāo)本均成功測序。②測序結(jié)果表明有2例患者肝內(nèi)HBV cccDNA、HBV rcDNA和血清中HBV DNA均有rtM204I變異；有2例患者肝內(nèi)分別存在rtM204I、rtQ215H變異，而血清標(biāo)本未檢測到相應(yīng)變異；3例患者血清中分別表現(xiàn)存在rtM204V、rt