補(bǔ)益肝腎活血化瘀中藥復(fù)方對大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變模型干預(yù)作用的研究.pdf

1、糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic polyneuropathy,DPN)是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥,可累及90％以上的糖尿病患者。隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升,DPN的發(fā)病率也在不斷增長。DPN發(fā)病隱匿,通常在嚴(yán)重累及感覺神經(jīng)和運動神經(jīng),產(chǎn)生肢體麻木或疼痛、運動障礙、肌肉萎縮時才被發(fā)現(xiàn),異常的疼痛、足部潰瘍等癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。
　　 DPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,明確參與DPN發(fā)病的因素包括神經(jīng)微血管和血液流變學(xué)

2、異常和多元醇通路活性增加,神經(jīng)微血管血流障礙導(dǎo)致神經(jīng)缺血缺氧引發(fā)神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)的損害；多元醇通路活性增高導(dǎo)致Na+/K+-ATP酶活性降低,胞內(nèi)Na+和K+失衡,與神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)形態(tài)學(xué)異常直接相關(guān)。P物質(zhì)參與神經(jīng)生長發(fā)育成熟,與DPN時神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)受損的恢復(fù)密切相關(guān)。
　　 發(fā)病機(jī)制的不明確為DPN的治療帶來困難,國內(nèi)外均缺乏特異性的治療方法及藥物。西醫(yī)除控制血糖外,多采用鎮(zhèn)痛藥、維生素B12、血管擴(kuò)張劑、抗氧化及補(bǔ)充神經(jīng)

3、營養(yǎng)因子等對癥治療,效果多不理想。近年來中藥在治療DPN方面取得了一些進(jìn)展,并因其療效肯定,副作用小而逐漸得到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。但是復(fù)方湯劑服用不便限制了中藥療效的發(fā)揮與廣泛應(yīng)用,因而需要有效治療DPN的中成藥物的出現(xiàn)。
　　 JTT是集十余年臨床經(jīng)驗,以補(bǔ)益肝腎、活血化瘀為治法的中藥復(fù)方。其采取的治法有別于傳統(tǒng)中醫(yī)理論對糖尿病周圍神經(jīng)病變的祛風(fēng)、活血化瘀、益氣活血、益氣養(yǎng)陰活血化瘀等治法。十余年的臨床實踐顯示,其在減輕患者麻木

4、、疼痛等臨床癥狀,改善分度音叉振動覺、血液流變學(xué)指標(biāo)及肌電圖腓總神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度等方面取得了較好的臨床療效。
　　 1目的
　　 本實驗旨在觀察JTT提取物對糖尿病周圍神經(jīng)病變模型大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)損傷的干預(yù)作用,探索其可能的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)研究基礎(chǔ)。
　　 2方法
　　 本實驗采用鏈脈佐菌素(Streptozotocin,STZ)進(jìn)行一次性腹腔注射誘導(dǎo)DPN大鼠模型。按血糖值篩選出符合成

5、模標(biāo)準(zhǔn)的DPN模型大鼠后,將其按血糖值隨機(jī)分為模型組、甲鈷銨組、JTT提取物大、中、小劑量組,另取同鼠齡正常大鼠作為正常組。除模型組外,其余四組于造模1周后,分別以甲鈷銨和大(12.6 g/kg)、中(6.3 g/kg)、小(3.2 g/kg)三個劑量的JTT提取物連續(xù)灌胃給藥8周,并觀察大鼠精神、活動、體重、血糖等一般狀態(tài)的變化,給藥8周(即造模9周)后測定坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度用以評價神經(jīng)功能,用免疫組化方法檢測坐骨神經(jīng)中神經(jīng)肽P物質(zhì)表達(dá)

6、量,取胰腺觀察其光鏡下組織形態(tài)學(xué)改變,取坐骨神經(jīng)觀察其光鏡下結(jié)構(gòu)和電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變用以評價神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)改變,測定坐骨神經(jīng)鈉鉀ATP酶活性,并測定血液流變學(xué)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。
　　 3結(jié)果
　　 3.1一般狀態(tài)的研究
　　 與正常組相比,造模1周后,模型組大鼠血糖明顯升高(p<0.01),出現(xiàn)明顯的消瘦、精神萎糜、活動減少、皮毛不榮等表現(xiàn),“三多一少”癥狀明顯,即多飲、多食、多尿、體重明顯減輕(p<0.01),

7、其尿液發(fā)出腐爛蘋果的氣味,以上癥狀持續(xù)到實驗結(jié)束時。造模5周時,模型組部分大鼠出現(xiàn)煩躁不安,攻擊性強(qiáng),步態(tài)不穩(wěn)等神經(jīng)功能障礙的癥狀。
　　 與模型組相比,各給藥組大鼠血糖均未見明顯降低,整個實驗期間各給藥組大鼠進(jìn)食量、飲水量和尿量均未見明顯減少,其尿液仍有腐爛蘋果氣味兒,但是其精神狀態(tài)較好,未見大鼠精神萎靡。給藥2周時,JTT提取物大劑量組體重下降即有明顯改善,這種改善一直維持到給藥結(jié)束。甲鈷銨組體重下降的改善在給藥7周時才出現(xiàn)

8、。整個實驗過程中,JTT大、中劑量組未見其出現(xiàn)煩躁不安,攻擊性強(qiáng),步態(tài)不穩(wěn)等表現(xiàn),甲鈷銨組仍可見步態(tài)不穩(wěn)的表現(xiàn)。
　　 3.2神經(jīng)功能的研究
　　 與正常組相比,模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期明顯縮短(P<0.01),坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢(P<0.01)。與模型組相比,給藥8周后,各給藥組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期均有不同程度的縮短,各給藥組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度均有不同程度的提高。其中JTT大劑量組大鼠的潛伏期和坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度接

9、近正常,與模型組相比坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度提高1倍,甲鈷銨組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度提高約60％,JTT中、小劑量組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度分別提高45％和36％。
　　 3.3組織形態(tài)的研究
　　 采用變色酸2R-亮綠髓鞘特殊染色方法對坐骨神經(jīng)進(jìn)行染色,光鏡下觀查結(jié)果顯示,正常大鼠坐骨神經(jīng)橫切面,有髓神經(jīng)纖維密集、排列整齊,有髓神經(jīng)纖維髓鞘呈現(xiàn)紅色同心圓結(jié)構(gòu),提示髓鞘結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面,有髓神經(jīng)纖維排列疏松紊亂,出現(xiàn)大量

10、白色同心圓結(jié)構(gòu),提示髓鞘結(jié)構(gòu)不完整或脫髓鞘改變。甲鈷銨組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面部分有髓神經(jīng)纖維排列紊亂,可見少量白色同心圓結(jié)構(gòu),提示部分神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)不完整。JTT大劑量組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面,有髓神經(jīng)纖維密集,排列整齊,偶見白色同心圓結(jié)構(gòu),提示大部分有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整。JTT中、小劑量組大鼠坐骨神經(jīng)橫切面部分有髓神經(jīng)纖維排列疏松、紊亂,可見白色同心圓結(jié)構(gòu),提示部分神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)不完整。
　　 經(jīng)過圖像分析軟件對有髓神經(jīng)纖維髓鞘

11、面積平均光密度的半定量分析,與正常組相比,模型組大鼠髓鞘面積平均光密度明顯減低(P<0.01)。與模型組相比,JTT大劑量組大鼠髓鞘面積平均光密度明顯增加(P<0.01),甲鈷銨組、JTT中、小劑量組大鼠髓鞘面積平均光密度也明顯增加(P<0.05)。
　　 采用透射電鏡觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示正常大鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)完整呈同心圓板層結(jié)構(gòu),髓鞘厚薄均勻,密度一致,雪旺細(xì)胞排列整齊,軸索無腫脹或萎縮,微

12、管微絲分布均勻。模型組大鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)不完整,板層結(jié)構(gòu)分離明顯,出現(xiàn)明顯的脫髓鞘改變,雪旺細(xì)胞排列紊亂,軸突萎縮,被變性的髓鞘擠壓成不規(guī)則型,軸突內(nèi)微管、微絲分布不均勻。甲鈷銨組大鼠坐骨神經(jīng)的部分有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)不完整,部分髓鞘板層分離,軸突萎縮形狀不規(guī)則,軸突內(nèi)微管、微絲分布不均勻。JTT大劑量組大鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)完整,偶見節(jié)段性脫髓鞘,軸突輕度萎縮,軸突內(nèi)微管、微絲分布較均勻。JTT中劑量

13、組大鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)較完整,可見節(jié)段性脫髓鞘,軸突輕度萎縮,軸突內(nèi)微管、微絲分布不均勻。JTT小劑量組大鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)不完整,可見節(jié)段性脫髓鞘,軸突萎縮,軸突內(nèi)微管、微絲分布不均勻。對坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)病變程度進(jìn)行病理分級及秩和檢驗,結(jié)果顯示甲鈷銨和JTT大、中劑量能減輕DPN大鼠坐骨神經(jīng)病變程度。
　　 坐骨神經(jīng)冰凍切片P物質(zhì)免疫組化染色結(jié)果顯示,模型組大鼠坐骨神經(jīng)P物質(zhì)表達(dá)明顯降低,與模型

14、組相比,JTT提取物大劑量組大鼠坐骨神經(jīng)P物質(zhì)明顯升高。
　　 胰島HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示,正常大鼠胰島結(jié)構(gòu)完整,分布均勻,大小適中,DPN模型組大鼠胰島數(shù)量減少,體積明顯縮小。胰島形狀不規(guī)則,外周不整齊,部分動物的胰島切片很難找到胰島。甲鈷銨組大鼠胰島數(shù)量減少,體積縮小。胰島形狀不規(guī)則,個別動物胰島結(jié)構(gòu)不清楚。JTT提取物大劑量組胰島數(shù)量仍然較少,部分動物胰島體積較大,胰島細(xì)胞有所增加。JTT提取物中、小劑量組胰島數(shù)量仍然較

15、少,體積較小,胰島細(xì)胞較少,可見空泡變性。
　　 3.4神經(jīng)組織生化的研究
　　 坐骨神經(jīng)組織Na+/K+-ATP酶活性測定結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠坐骨神經(jīng)組織酶活性明顯降低(P<0.01)。
　　 與模型組相比,甲鈷銨組大鼠坐骨神經(jīng)組織Na+/K+-ATP酶活性明顯升高(P<0.05),JTT大劑量組大鼠坐骨神經(jīng)組織Na+/K+-ATP酶活性明顯升高(P<0.05),JTT中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)組織Na

16、+/K+-ATP酶活性明顯升高(P<0.01),較甲鈷銨組更接近正常值,JTT中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)組織Na+/K+-ATP酶活性有增高趨勢但無顯著差異。
　　 3.5血液流變學(xué)研究
　　 血液流變學(xué)檢測結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠高切變率(200/s)、中切變率(30/s)、低切變率(5/s、1/s)下的全血粘度均明顯升高,血漿粘度明顯升高,紅細(xì)胞壓積明顯升高。與模型組相比,JTT大劑量組大鼠高切變率下的全血粘度無

17、顯著性差異,中、低切變率下的全血粘度明顯降低,血漿粘度無明顯差異,紅細(xì)胞壓積明顯降低；JTT中、小劑量組大鼠高切變率下的全血粘度無顯著性差異,中、低切變率下的全血粘度明顯降低,紅細(xì)胞壓積有降低趨勢但無顯著性差異。
　　 4結(jié)論
　　 JTT提取物12.6g生藥/kg能夠明顯提高DPN模型大鼠坐骨神經(jīng)組織Na+/K+-ATP酶活性,明顯提高其坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、降低血液粘稠度,減輕DPN模型大鼠坐骨神經(jīng)組織的病理性損傷。