天然反義轉(zhuǎn)錄本TSPAN31調(diào)控CDK4基因表達及其對肝癌細胞侵襲和遷移的影響.pdf

1、目的：
　　四跨膜蛋白超家族（transmembrane4 super family，TM4SF）是一類小分子糖蛋白，具有四個高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，目前在人類中已發(fā)現(xiàn)33個不同的TM4SF成員。四跨膜蛋白家族成員之間或與細胞膜表面分子相互作用，形成跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控細胞增殖、分化、細胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TSPAN31是四跨膜蛋白超家族重要成員之一。文獻報道，TSPAN31可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而，對 TS

2、PAN31功能及分子機制的研究尚未見報道。本課題我們著重研究TSPAN31在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演的角色，進一步探討它們在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達調(diào)控機制及其意義。
　　方法：
　　通過天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫（NATsDB）查詢 TSPAN31與 CDK4基因；利用Real-time PCR技術(shù)檢測天然反義轉(zhuǎn)錄本TSPAN31與靶基因CDK4在肝癌細胞中的表達；在肝癌細胞中，利用干擾或過表達TSPAN31的方法檢測CDK4表達變化

3、，利用補救實驗探討TSPAN31對CDK4發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制；通過雙熒光素酶報告基因檢測細胞熒光素酶活性；利用侵襲實驗和遷移實驗檢測 siRNA沉默 TSPAN31對肝癌細胞運動能力的影響；通過細胞免疫熒光實驗分析下調(diào) TSPAN31后細胞中β-catenin蛋白的分布情況；利用siRNA沉默TSPAN31或p53和藥物干預(yù)的方法探討TSPAN31在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用。
　　結(jié)果：
　　天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫（NATsD

4、B）顯示TSPAN31與CDK4屬于一對順式天然反義轉(zhuǎn)錄本。在肝癌細胞中，siRNA沉默TSPAN31上調(diào)CDK4 mRNA和蛋白水平，且TSPAN31主要通過3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)CDK4表達。雙熒光素酶報告基因檢測顯示miR-135b靶向調(diào)控TSPAN31。PI3K小分子抑制劑LY-294002抑制miR-135b表達，上調(diào)TSPAN31 mRNA表達水平。
　　siRNA沉默 TSPAN31有效抑制肝癌細胞侵襲和遷移能力。TSPA

5、N31調(diào)控MT1-MMP介導(dǎo)的MMP2活性。我們在觀察siRNA沉默TSPAN31對PI3K/AKT信號通路上相關(guān)基因表達變化時發(fā)現(xiàn)，TSPAN31表達下調(diào)抑制 pAKT、pGSK3β和β-catenin蛋白表達。細胞免疫熒光實驗顯示 TSPAN31下調(diào)后細胞核內(nèi)分布的β-catenin蛋白減少。在肝癌細胞中，siRNA沉默p53促進TSPAN31表達，MDM2小分子拮抗劑 Nutlin-3下調(diào) TSPAN31 mRNA和蛋白水平，這提