環(huán)孢素A對(duì)正常人PBMCs產(chǎn)生IFN-γ的抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、環(huán)孢素A(cyclosporinA，CsA)是一種傳統(tǒng)的免疫抑制劑。自從CsA于二十世紀(jì)七十年代末廣泛應(yīng)用于器官和組織移植后的抗排斥反應(yīng)治療以來(lái)，影響病人生存率的急性排斥反應(yīng)和早期免疫抑制劑嚴(yán)重負(fù)作用已經(jīng)大大地降低，腎、肝、心、胰腺、肺和小腸的同種異體移植取得了巨大的進(jìn)展[1-3]?，F(xiàn)今，CsA仍然是器官移植成功的關(guān)鍵因素，世界上有數(shù)十萬(wàn)器官移植患者依靠CsA維持生命，正在進(jìn)行的聯(lián)和CsA作為核心免疫移植方案的試驗(yàn)，旨在為優(yōu)化CsA的應(yīng)

2、用和提高移植患者臨床結(jié)果提供最新的方案[4-7]。近年來(lái)，CsA用于治療銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓膜炎等自身免疫性疾病，成為治療多種自身免疫反應(yīng)性疾病的常規(guī)用藥[8-10]。目前，在體內(nèi)外對(duì)CsA的免疫抑制作用進(jìn)行了廣泛的研究，CsA抑制IL-2的產(chǎn)生和CTL的活性的能力，主要通過(guò)干擾T-淋巴細(xì)胞的信息傳遞通道而抑制其功能[10-13]。 CsA是一個(gè)由11種氨基酸組成的肽，CsA發(fā)揮免疫抑制作用是通過(guò)與富含于胞

3、漿內(nèi)的CsA受體(cyclophilin，CyP)相互作用并抑制鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CN)分子而完成。CsA與CyP形成CyP/CsA復(fù)合物，作用于鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CN)分子，使CN去磷酸化作用被阻斷。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，CN對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-NT的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性作用。通過(guò)抑制CN的活性，CsA阻止了編碼細(xì)胞因子(IL-2，IFN-γ)和它們受體基因的誘導(dǎo)，細(xì)胞免疫和體液免疫被抑制。最終使機(jī)體免疫排斥作用

4、被抑制[14-17]。 除了作用于T細(xì)胞外，CsA對(duì)人體免疫系統(tǒng)中不同的細(xì)胞亞群，比如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞亞群有著不同的影響[18-22]。通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化，抑制細(xì)胞表面活化分子CD25、CD69的表達(dá)[23-25]。并且抑制細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ等的產(chǎn)生[26-27]。抑制樹突狀細(xì)胞的分化，抑制IL-12、IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 器官移植和自身免疫性疾病的免疫學(xué)機(jī)制的主要共同點(diǎn)是由細(xì)胞免

5、疫所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答參與，包括Th1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。抗原提呈細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-12，可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化，CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖以及增加細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生，因此促進(jìn)了細(xì)胞免疫功能[28，29]。體內(nèi)外的研究證明，當(dāng)IL-12和/或IFN-γ被抑制、基因被敲除或基因突變后，細(xì)胞免疫下降，某些自身免疫性疾病得以控制[30-34]，移植物的存活時(shí)間延長(zhǎng)[35-38]。 CsA對(duì)

6、細(xì)胞免疫作用機(jī)制還不是十分明確，因此我們從細(xì)胞免疫角度上，研究CsA對(duì)不同的細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞活化分子的表達(dá)。進(jìn)一步揭示CsA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用CsA提供了理論依據(jù)。 目的探討在不同刺激條件下，CsA對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)γ-干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)產(chǎn)生的作用，及其作用機(jī)制的研究。 方法(1)密度梯度離心法分離正常人PBMCs，在CsA存在或不存在的情況下，用

7、抗CD3單克隆抗體(anti-CD3)、anti-CD3和抗CD28(anti-CD28)單克隆抗體、細(xì)胞因子IL-12或在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLC)中刺激培養(yǎng)細(xì)胞，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ產(chǎn)生的量，觀察CsA對(duì)對(duì)IFN-γ產(chǎn)生的影響。在CsA存在或不存在的情況下，anti-CD3或MLC刺激培養(yǎng)細(xì)胞后，收集細(xì)胞，加入不同濃度IL-12，用ELISA方法檢測(cè)兩次培養(yǎng)上清中IFN-γ產(chǎn)生的量，觀察CsA對(duì)Th1細(xì)胞分化的影

8、響。 (2)在CsA存在或不存在的情況下，anti-CD3刺激培養(yǎng)細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀，在單個(gè)細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)CsA對(duì)T淋巴細(xì)胞表面活化分子CD25、細(xì)胞表面分子IL-12R及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2產(chǎn)生的影響。 結(jié)果(1)正常人PBMCs在未經(jīng)任何刺激的情況下不產(chǎn)生IFN-γ，anti-CD3、anti-CD3和anti-CD28或MLC刺激后產(chǎn)生大量的IFN-γ，在刺激的同時(shí)加入CsA，CsA呈劑量依賴性抑

9、制IFN-γ的產(chǎn)生。 (2)PBMCs經(jīng)anti-CD3或anti-CD3和不同濃度的IL-12培養(yǎng)3d，IL-12能增強(qiáng)anti-CD3刺激后PBMCs產(chǎn)生IFN-γ的量。 (3)在CsA有效抑制anti-CD3和MLC產(chǎn)生IFN-γ的情況下，預(yù)先用CsA處理的細(xì)胞與未處理組相比，IL-12誘導(dǎo)IFN-γ的量顯著減少。 (4)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的結(jié)果表明，CsA不僅抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞

10、的百分率，同時(shí)還抑制IFN-γ的表達(dá)密度。CsA抑制CD4+IL-2產(chǎn)生細(xì)胞的百分率。 (5)Anti-CD3刺激PBMCs3d后，CD4+T細(xì)胞(12.30％)和CD8+T(5.15％)細(xì)胞均表達(dá)CD25，CsA抑制CD4+(7.77％)和CD8+(1.64％)T淋巴細(xì)胞CD25分子的表達(dá)百分率。 (6)當(dāng)anti-CD3刺激PBMCs3d后，CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)IL-12Rβ1和IL-12Rβ2均增高，CsA