HBV抗原誘導(dǎo)正常人淋巴細(xì)胞凋亡及胸腺肽α1對(duì)其凋亡抑制作用的研究.pdf

1、目的：研究HBV抗原對(duì)正常人淋巴細(xì)胞凋亡的影響及胸腺肽a1抑制HBV抗原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的作用，并探討其意義。 方法: (一)淋巴細(xì)胞的分離: 取健康人靜脈血，肝素抗凝，用1640培養(yǎng)液對(duì)倍稀釋，緩緩加到淋巴細(xì)胞分離液上層，離心，吸取淋巴細(xì)胞，洗滌后用1640培養(yǎng)液配成2×106/ml的細(xì)胞懸液。 (二)HBV陽(yáng)性血清(HBV(+)S)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)： 將淋巴細(xì)胞懸液分為四組：①胎牛血清(

2、FCS)對(duì)照組：0.9ml淋巴細(xì)胞懸液+0.1ml FCS；②正常人血清(NHS)對(duì)照組：0.9ml淋巴細(xì)胞懸液+0.1ml NHS；③HBV(+)S實(shí)驗(yàn)組：0.9ml淋巴細(xì)胞懸液+0.1ml HBV(+)S(不同HBV DNA含量：2.33×107 copy/ml、3.47×108 copy/ml、4.70×109 copy/ml)；④地塞米松(DEX)陽(yáng)性對(duì)照組：0.9ml淋巴細(xì)胞懸液+0.1ml FCS+DEX(終濃度為1×10-

3、5mol/L)，每組設(shè)6個(gè)平行孔。將各組細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育，于培養(yǎng)不同時(shí)間收集培養(yǎng)細(xì)胞，分別用瑞氏染色法及原位缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)觀察凋亡淋巴細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算凋亡率；流式細(xì)胞儀(FCM)碘化丙啶(PI)染色法分析亞二倍體峰，計(jì)算凋亡率。 同時(shí)設(shè)新鮮淋巴細(xì)胞對(duì)照組：取新分離淋巴細(xì)胞，不經(jīng)培

4、養(yǎng)，直接用上述方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡情況。 (三)胸腺肽疊a1(Ta1)對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)： 實(shí)驗(yàn)分組與上述相同，再于各組分別加入不同劑量的Ta1(終濃度分別為：0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml與1O0μg/ml)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，其它步驟同前，于培養(yǎng)72h收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： (一)凋亡淋巴細(xì)胞的特征： 光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)主要特征為：

5、用瑞氏染色法光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，邊聚及形成凋亡小體；TUNEL染色光鏡下可見(jiàn)凋亡淋巴細(xì)胞核染棕褐色; 流式細(xì)胞術(shù)檢出凋亡特征性亞二倍體峰。 (二)HBV抗原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果： HBV(+)S實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯高于NHS對(duì)照組及FCS對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)，提示HBV(+)S促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于NHS，其凋亡率隨HBV DNA.含量的升高而增加，低劑量組(HBV DNA含量為2.33×1

6、07 copy/ml)、中劑量組(HBV DNA含量為3.47×108copy/ml)、高劑量組(HBV DNA含量為4.70×109 copy/ml)之間比較差異有顯著意義(P＜0.01)。其凋亡率與HBV DNA含量呈正相關(guān)(r=0.813。P＜0.01)，并且細(xì)胞凋亡率的升高具有時(shí)間依賴性，未經(jīng)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞幾乎不出現(xiàn)凋亡，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率逐漸升高，培養(yǎng)24h、48h、72h組間比較，差異有顯著性(P＜0.01)，淋巴細(xì)胞

7、凋亡率與時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.846，P＜0.01)。 (三)Tal抑制HBV誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 在FCS對(duì)照組、NHS對(duì)照組及HBV(+)S組分別加入中、高劑量Tal(50μg/ml、100μg/ml)時(shí)，與未加藥組(0μg/ml)比較，均顯示出明顯抑制淋巴細(xì)胞凋亡的作用(P＜0.01)；但加入低劑量Tal(10μg/ml)時(shí)，僅有HBV(+)S組顯示出明顯抑制淋巴細(xì)胞凋亡的作用(P＜0.01)，而NHS及FC

8、S對(duì)照組與相應(yīng)未加藥組(0μg/ml)比較，未出現(xiàn)明顯抑制淋巴細(xì)胞凋亡的作用(P＞0.05)。Tal不同劑量組間比較差異有顯著性意義(P＜0.01)，Tal對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡抑制作用呈劑量依賴性，其藥物濃度與淋巴細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.683，P＜0.01)。 結(jié)論： ①本實(shí)驗(yàn)成功地建立了檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)方法，包括瑞氏染色法、TUNEL染色法、流式細(xì)胞儀術(shù)(PI染色)。 ②首次采用多種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法較