轉(zhuǎn)基因抗病蟲與高賴氨酸水稻的改良研究.pdf

1、水稻是最重要的糧食作物之一，同時也是世界超過一半人口的主糧。然而近些年來，水稻病蟲害嚴重的影響了水稻的產(chǎn)量，對糧食安全產(chǎn)生巨大的威脅。目前防治水稻病蟲害的方法主要是依賴化學殺蟲、殺菌劑，雖然在一定程度上控制了其危害的程度，但是化學噴施同時造成了嚴重的環(huán)境污染，而且費時費力，因此急需替代的方法。與此同時，由于長年以來人們對雜交水稻產(chǎn)量的過分關(guān)注，在一定程度上忽略了雜交水稻品質(zhì)的改良，使得商品糧的稻米品質(zhì)長期停滯不前。因此，綜合改良水稻產(chǎn)量

2、、品質(zhì)以及抗性等性狀已迫在眉睫。
　　隨著植物分子生物學的發(fā)展，使得通過植物基因工程手段來改良水稻病蟲害抗性及稻米品質(zhì)成為了可能。本研究利用常規(guī)雜交及分子標記輔助選擇的方法，對含轉(zhuǎn)Bt（cry1Ab/1Ac）基因光溫敏雄性不育系208S進行了抗蟲蛋白含量的檢測及其后代Bt基因拷貝數(shù)的分析，并考察了其雜種后代的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。為了改良該不育系的稻瘟病抗性，本研究將208S與聚合了抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的恢復(fù)系材料華1517B進行雜

3、交轉(zhuǎn)育，獲得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。在稻米品質(zhì)改良方面，本研究對轉(zhuǎn)LYSINE-RICH PROTEIN(LRP)基因材料PA110及其后代進行了遺傳穩(wěn)定性及稻米氨基酸含量檢測分析，初步研究了該基因增加種子中賴氨酸含量的分子遺傳機理。同時通過傳統(tǒng)回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合分子標記輔助選擇的方法將LRP基因?qū)氲剿酒贩N9311中，使得賴氨酸等必需氨基酸得到一定程度提高，改良了稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。本研究的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　(1)

4、隨著植株生長發(fā)育，不育系材料208S及其雜種浙優(yōu)3號中Cry1Ab/1Ac蛋白含量呈現(xiàn)逐步下降的趨勢;在葉片及莖稈中，Cry1Ab/1Ac蛋白的豐度要顯著高于其在胚乳及根部中的豐度;在所檢測的各個生長階段及不同組織中，Cry1Ab/1Ac蛋白的含量與其供體親本華恢1號（又名TT51）中的含量處于相同水平;cry1Ab/1Ac基因在不同遺傳背景下均可以穩(wěn)定表達，同時其在純合及雜合狀態(tài)下并沒有出現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)。
　　(2) Sout

5、hern blot轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測顯示，208S及其雜種后代浙優(yōu)3號、浙優(yōu)5號及02567同供體親本TT51一樣，均為中cry1Ab/1Ac基因雙拷貝材料。
　　(3)不育系材料208S配組的三個材料產(chǎn)量均表現(xiàn)良好，其中浙優(yōu)3號及浙優(yōu)5號優(yōu)于南方稻區(qū)的主栽品種豐兩優(yōu)4號;208S及浙優(yōu)3號的絕大多數(shù)品質(zhì)性狀均達到或超過國標優(yōu)質(zhì)米一級標準。
　　(4)利用MAS及回交育種手段，將水稻材料華1517B中的抗稻瘟病基因Pi1、Pi

6、2成功導入到不育系208S中，獲得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。利用基因組中平均分布的并且在親本間(208S、華1517B)具有多態(tài)性的120個分子標記，對改良株系進行了遺傳背景回復(fù)情況分析。結(jié)果表明，通過雜交及三次的回交，待改良單株材料的背景回復(fù)率已經(jīng)達到96.7％，主要農(nóng)藝性狀與親本208S無顯著性差異。在育性方面，改良材料在夏季杭州表現(xiàn)出完全的不育狀態(tài)，而在冬季海南則表現(xiàn)出部分可育狀態(tài)，與親本208S表現(xiàn)一致，同時該材料主要農(nóng)藝

7、性狀也與親本208S無顯著差異。
　　(5)改良稻瘟病抗性的株系在湖北省恩施市國家稻瘟病鑒定點表現(xiàn)為4級中度抗性，顯著的優(yōu)于親本對照208S（7級）;改良稻瘟病抗性株系在海南三亞試驗田表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟表現(xiàn)出完全的抗性，并與親本對照208S的抗蟲表現(xiàn)一致。
　　(6)定量qRT-PCR檢測LRP基因的表達模式后發(fā)現(xiàn)，LRP基因在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達量極低;隨著灌漿時間的增加，胚乳中LRP基因的表達量急劇增加，說明LRP基因

8、在PA110不同組織中表達量的變化情況與其Gt1啟動子的表達模式一致。在PA110胚乳中，外源的LRP基因?qū)φ麄€天冬氨酸代謝途徑相關(guān)酶基因均產(chǎn)生了一定影響;結(jié)果同時顯示，PA110胚乳中賴氨酸分解代謝的減少，可能導致總的賴氨酸含量較對照顯著的增加;對9個水稻種子貯藏蛋白相關(guān)基因進行表達量分析后發(fā)現(xiàn)，這些基因的表達量隨著胚乳的發(fā)育呈現(xiàn)上升表達趨勢，但是在PA110中，這些基因表達量的上升幅度并沒有在對照品種中上升的幅度大。
　　(7

9、)在PA110種子中，包括賴氨酸在內(nèi)的幾乎所有氨基酸含量較對照均有一定程度提升，其中賴氨酸含量在糙米和精米中較對照分別提升了30.1％和28.0％，總氨基酸含量分別提升了21.3％和22.4％;在PA110葉片中，隨著植株的生長發(fā)育，各個游離氨基酸含量呈現(xiàn)上升趨勢;在成熟期，PA110中所有游離氨基酸含量均較對照有了明顯增加，其中賴氨酸增加幅度顯著。
　　(8)在LRP基因?qū)氩牧?311LRP中后，賴氨酸含量較對照僅有7.3％的

10、增加，而其它大部分氨基酸含量均有小幅度的降低，說明LRP基因在不同的遺傳背景條件下對提升賴氨酸的作用會有所差異;在PA110與9311的雜交衍生系中，糙米中的賴氨酸含量較雜種對照提升明顯(19.6％)，而在PA64S與9311LRP的雜交衍生系中，糙米的賴氨酸含量較雜種對照出現(xiàn)了2.4％的降低，說明LRP基因在應(yīng)用到雜交水稻的過程中，其在不育系背景中的表現(xiàn)可能會比其在恢復(fù)系背景中更有應(yīng)用潛力;在PA110與9311LRP的雜交衍生系中，

11、雖然LRP基因型為純合狀態(tài)，然而在糙米中賴氨酸含量較雜種對照僅有9.2％的增加，說明LRP基因處于雜合狀態(tài)可能對提高雜種種子中賴氨酸含量更具應(yīng)用潛力。
　　(9)轉(zhuǎn)基因材料PA110的株高與對照相比有著較明顯的降低，同時，PA110自交種子的千粒重及種子發(fā)芽率也較對照有著顯著的下降;對PA110成熟階段花粉進行電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，PA110中的外源LRP基因并未對不育系水稻的育性產(chǎn)生明顯影響;PA110衍生系9311LRP與對照931

12、1在株高、每穗粒數(shù)、千粒重、種子萌發(fā)率等農(nóng)藝性狀方面存在一定負面效應(yīng)，說明在9311背景下，種子胚乳中表達外源LRP基因可能會影響種子的灌漿充實度，并影響種子萌發(fā);在雜交種PA110/9311(LRP雜合基因型)中，包括千粒重在內(nèi)的其他主要農(nóng)藝性狀均沒有發(fā)生顯著變化，說明雜種優(yōu)勢可能在一定程度上互補了PA110中農(nóng)藝性狀的負面效應(yīng)。然而PA64S/9311LRP(LRP雜合基因型)較對照表現(xiàn)出千粒重的顯著下降;LRP純合基因型的組合PA

13、110/9311LRP也表現(xiàn)出千粒重較對照的顯著下降;以上結(jié)果表明，外源LRP基因在不同水稻遺傳背景下對水稻農(nóng)藝性狀的影響存在一定的差異;在不育系中適度表達LRP基因，并獲得的雜交品系在改良雜種賴氨酸含量方面更具有應(yīng)用的價值。
　　(10)利用MAS結(jié)合傳統(tǒng)雜交的方法，獲得了聚合cry1Ac及LRP基因的改良材料9311LRP/cry1Ac;聚合材料表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟及二化螟良好的抗性，說明LRP基因并不會影響cry1Ac基因?qū)γ?/p>