母體血漿中胎兒DNA點(diǎn)突變新型檢測技術(shù)在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中價(jià)值的研究.pdf

1、背景與目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)在妊娠過程中母體血漿中存在游離胎兒DNA，這一發(fā)現(xiàn)為基于母體外周血的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開辟了新的領(lǐng)域。胎兒DNA一半來自于母親，另一半來自于父親，目前已報(bào)道利用母體血漿DNA來檢測胎兒父系來源的致病基因，可應(yīng)用于父親為常染色體顯性遺傳病患者的胎兒無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，而且將這種檢測方法應(yīng)用于父親為常染色體隱性遺傳病攜帶者的產(chǎn)前診斷，也可使50％的胎兒避免了傳統(tǒng)的絨毛吸取或羊膜腔穿刺檢查。但由于母體血漿總DNA量少，且在血

2、漿總DNA中胎兒DNA所占的比例甚微，母體等位DNA片段可干擾胎兒DNA的檢測，因此對(duì)這種低豐度胎兒DNA檢測必須采用高靈敏度和高特異性的分析系統(tǒng)。點(diǎn)突變或單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的檢測是目前DNA分子診斷中的主要研究內(nèi)容，對(duì)母體血漿中的這些單核苷酸差異的檢測在技術(shù)上要求更高，目前所用的檢測方法仍不夠理想。DNA連接酶對(duì)單個(gè)核苷酸差異具有很強(qiáng)的鑒別能力，其核心在于它可以把與模板完

3、全配對(duì)的兩相鄰寡核苷酸片段連接起來，如果連接處出現(xiàn)一個(gè)堿基錯(cuò)配，連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。以該酶為基礎(chǔ)的技術(shù)如空隙-連接酶鏈反應(yīng)(gapligasechainreaction，Gap-LCR)和連接酶檢測反應(yīng)(1igasedetectionreaction，LDR)在低豐度基因單核苷酸差異檢測方面具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。因此本研究擬以β地中海貧血的常見突變和雌激素受體α的SNP位點(diǎn)(c.454-397T＞C)作為研究對(duì)象，在Gap-LCR或LDR

4、技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光定量PCR、毛細(xì)管電泳和納米金新型通用型芯片來檢測低豐度基因的單核苷酸差異，探索檢測母體血漿中胎兒父系來源DNA點(diǎn)突變的新方法，為胎兒遺傳性疾病的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷尋求新的有效途徑。 主要方法與結(jié)果如下： 第一部分：母體血漿DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?1.用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測β地中海貧血ⅣS-Ⅱ-654(C→T)、CD17(A→T)、CD26(G→A)、CD41-42(-CTTT)和CD71-72(

5、+A)突變的外周血標(biāo)本，然后進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在突變位點(diǎn)周圍存在SNP時(shí)可造成誤診。 2.利用pVUⅡ限制酶酶切方法鑒定雌激素受體α基因SNP(c.454-397T＞C)分型，并進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果表明，酶切鑒定結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。 3.根據(jù)母體血漿中母體DNA和胎兒DNA的比例，利用上述的基因突變和SNP分型檢測結(jié)果，將不同比例含檢測突變/SNP的DNA和未含該突變/SNP的DNA混合

6、，模擬母體血漿DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有利于更好地研究母體血漿中胎兒DNA單核苷酸差異檢測方法的特異性和靈敏度。 第二部分：Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)在低豐度DNA點(diǎn)突變檢測中的應(yīng)用研究 1.為了更靈敏地檢測連接產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其中一對(duì)LCR引物進(jìn)行修飾，分別于上游引物的5'端和下游引物的3’端加入一段特異的序列，以此作為熒光定量PCR的識(shí)別序列，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。采用Gap-LCR技術(shù)特異性識(shí)別突變位點(diǎn)，若樣本存

7、在要檢測的突變，則產(chǎn)生連接產(chǎn)物，然后利用定量PCR技術(shù)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測，就可達(dá)到檢測低豐度DNA點(diǎn)突變的目的。 2.將20pg和2ng的CD17突變雜合子DNA標(biāo)本分別進(jìn)行15、20、25、30個(gè)循環(huán)的LCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著循環(huán)數(shù)增加，其產(chǎn)物量也相應(yīng)地增加，并提示用來檢測母體血漿DNA標(biāo)本時(shí)循環(huán)數(shù)可在20～25個(gè)之間進(jìn)行選擇。而利用200ng的正常DNA標(biāo)本進(jìn)行同樣的循環(huán)梯度LCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管在LCR擴(kuò)增過程中也可出現(xiàn)非特異性

8、產(chǎn)物，但產(chǎn)物量明顯低于20pgCD17突變雜合子DNA標(biāo)本相應(yīng)循環(huán)數(shù)的產(chǎn)物量，由此提示，此方法用于低豐度DNA點(diǎn)突變的檢測具有很高的靈敏度和較好的特異性。 3.利用Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)檢測含不同濃度CD17突變的DNA標(biāo)本：將含20pg、200pg、2nng、20ngCD17突變雜合子的DNA標(biāo)本分別進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的Gap-LCR，結(jié)果表明，LCR起始模板量的增加10倍，其產(chǎn)物量大約增加10倍，由此提示，此方法具

9、有較好的定量特性。 4.將含20pg或200pgCD17突變雜合子的DNA分別與1ng、10ng、100ng的正常DNA混合，作為LCR的模板。后分別利用Taqman探針法和SYBRGreenI染料法定量檢測LCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，不同濃度背景DNA下的CD17突變DNALCR產(chǎn)物數(shù)量基本一致，由此提示該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達(dá)到1∶10000(突變DNA序列與正常DNA序列之比)。 第三部分：PCR/LDR

10、結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)在母體血漿中胎兒DNA單核苷酸差異檢測中的應(yīng)用研究 1.首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶序列，然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用LDR技術(shù)特異地識(shí)別突變，其中LDR的一側(cè)引物用熒光標(biāo)記，最后用毛細(xì)管電泳技術(shù)來檢測連接產(chǎn)物。 2.DNA連接酶不同用量的LDR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一DNA連接酶用量對(duì)不同錯(cuò)配堿基對(duì)的識(shí)別能力不同，而過量使用DNA連接酶可出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，由此提示，DNA連接酶使用量與連接反應(yīng)的保真性有關(guān)。 3

11、.PCR/LDR/毛細(xì)管電泳方法的靈敏度檢測及母體血漿DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臋z測結(jié)果顯示，該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達(dá)到1∶10000。 4.抽取15-24周的孕婦外周血，利用pVUⅡ限制酶酶切方法鑒定25例孕婦的ERα基因SNP(c.454-397T＞C)分型，其中13例為純合子。提取母體血漿DNA后，利用PCR/LDR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果與臍帶血鑒定的新生兒的基因分型一致。 第四部分：PCR/LDR

12、結(jié)合納米金新型通用型芯片技術(shù)的建立及其在低豐度DNA點(diǎn)突變檢測中的應(yīng)用研究 1.首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶序列，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用LDR技術(shù)特異地識(shí)別突變，其中在LDR的上游引物的5’端連上標(biāo)簽(tag)序列，下游引物的3’端用生物素標(biāo)記，然后將5’端有tag序列和3’端有生物素標(biāo)記的連接產(chǎn)物與通用型芯片上的anti-tag序列(與tag互補(bǔ)的序列)進(jìn)行雜交，接著用鏈霉親和素修飾的納米金作為第二反應(yīng)物，與在芯片上雜交的連接產(chǎn)物以

13、生物素-鏈霉親和素反應(yīng)的方式相結(jié)合，經(jīng)銀顯影液放大后用普通CCD觀察結(jié)果。 2.PCR/LDR結(jié)合納米金新型通用型芯片技術(shù)的靈敏度檢測及母體血漿DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臋z測結(jié)果表明，該技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度可達(dá)到1∶1000，而化學(xué)發(fā)光法用于芯片信號(hào)檢測的靈敏度為1∶500。 結(jié)論： 1.將Gap-LCR和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，成功地建立了一種高靈敏度的低豐度基因點(diǎn)突變檢測技術(shù)，可用于母體血漿或血清中胎兒

14、DNA點(diǎn)突變檢測，同時(shí)可以對(duì)胎兒DNA進(jìn)行定量，有望成為基于母體血漿中胎兒DNA的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷和妊娠期相關(guān)疾病預(yù)測的新手段，同時(shí)也可在腫瘤的早期診斷等其它低豐度基因突變檢測領(lǐng)域中應(yīng)用，但由于需要兩次指數(shù)擴(kuò)增，在操作過程中必須防止擴(kuò)增污染。 2.PCR/LDR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)用于低豐度基因單核苷酸差異檢測也具有很高的靈敏度，可應(yīng)用于母體血漿中胎兒DNA點(diǎn)突變/SNP的檢測。由于PCR/LDR僅涉及到一次指數(shù)擴(kuò)增，而且因?yàn)長DR

15、為線性擴(kuò)增，即使在LDR過程中出現(xiàn)錯(cuò)配現(xiàn)象，也不會(huì)影響到后續(xù)的擴(kuò)增。與Gap-LCR結(jié)合熒光定量PCR的技術(shù)比較，其特異性高，而且擴(kuò)增污染的可能性明顯減小，顯然具有臨床實(shí)用價(jià)值，將大大拓展母體血漿中胎兒DNA在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用范圍。 3.PCR/LDR結(jié)合通用型芯片技術(shù)用于低豐度基因突變檢測的靈敏度較前面的技術(shù)低，但可大幅度提高標(biāo)本的檢測通量，且用納米金作為芯片信號(hào)報(bào)告分子，可達(dá)到母體血漿中胎兒父系來源的DNA點(diǎn)突變/SN