母血漿中胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前診斷β-地中海貧血方法的研究.pdf

1、背景和目的:
　　常用遺傳性疾病產(chǎn)前診斷技術(shù)手段多為有創(chuàng)性操作,對(duì)孕婦及胎兒均有一定傷害,以致在臨床推廣及應(yīng)用中受到限制。而非侵入性的產(chǎn)前檢查方法如中孕期母血清HCG、AFP定量及超聲檢查的檢測(cè)范圍各有側(cè)重,僅能作為遺傳性疾病篩查的一種手段,不能作為診斷依據(jù)。近年來,隨著胎兒游離 DNA的研究不斷深入使無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法取得巨大進(jìn)展,利用孕婦血漿檢測(cè)胎兒性別、RhD基因已經(jīng)在國(guó)外的一些產(chǎn)前診斷中心開展;利用全基因組高通量測(cè)序及數(shù)字

2、PCR等方法檢測(cè)單基因疾病已有報(bào)道,目前仍處于研究階段,成本昂貴,而且操作十分復(fù)雜。
　　β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱β-地貧)是一種由β-珠蛋白基因突變導(dǎo)致β-珠蛋白鏈合成減少或嚴(yán)重缺乏所引起的常染色體隱性遺傳單基因疾病,是以β珠蛋白基因單核苷酸突變及小片段缺失為主要分子學(xué)基礎(chǔ)。以該疾病作為研究對(duì)象,構(gòu)建高特異性、高靈敏度、可用于低豐度基因單核苷酸突變及小片段缺失檢測(cè)的技術(shù),可為利用母體血漿中胎兒?jiǎn)位蜻z傳性疾病的檢測(cè)尋求一種操作簡(jiǎn)單、

3、成本低的新方法。
　　2004年Lo在Lancet報(bào)道應(yīng)用等位特異性熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)β地中海貧血小片段缺失突變CD41-42(del-CTTT)。但由于等位特異性PCR檢測(cè)低豐度突變時(shí)敏感度不高,目前仍未應(yīng)用于臨床。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物3￠末端人為引入耐核酸酶外切的硫代磷酸修飾的堿基時(shí),若引物3￠末端與模板不能完全匹配,具有3′→5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶不能及時(shí)切除錯(cuò)配堿基,造成DNA聚合反應(yīng)的非成熟性終止,阻止引

4、物繼續(xù)延伸,有效地減少了PCR在檢測(cè)基因突變中常出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。這一研究現(xiàn)已應(yīng)用于部分單基因遺傳性疾病臨床樣本的檢測(cè),但目前未見應(yīng)用于低豐度基因突變的檢測(cè)。
　　在前期實(shí)驗(yàn)中,以β-地中海貧血常見的兩種單核苷酸突變位點(diǎn)為目標(biāo),利用常規(guī)PCR、LDR、毛細(xì)管電泳三者相結(jié)合的技術(shù)對(duì)所建立的地中海貧血胎兒母血漿 DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度為1:10000,因此證明該方法能夠滿足自孕婦血漿檢測(cè)胎兒父源性單核苷酸突變的要求。

5、但因在此實(shí)驗(yàn)中的PCR產(chǎn)物需要經(jīng)過純化,而后再將純化產(chǎn)物應(yīng)用于下一步LDR反應(yīng)中,在純化過程中極易污染,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　在本研究中,我們將高保真DNA聚合酶結(jié)合硫化修飾引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”與等位特異性實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合來檢測(cè)低豐度β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變,以期用于孕婦血漿中胎兒?jiǎn)位蚣膊⌒∑稳笔蛔兊臋z測(cè)。而對(duì)于基因單核苷酸突變的檢測(cè)方法,我們將立足于前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上進(jìn)行簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟等

6、改良,擬將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接應(yīng)用于LDR反應(yīng)后再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè),不再進(jìn)行純化等繁雜的操作步驟,以期達(dá)到減少污染、節(jié)約成本的目的。
　　材料和方法:
　　1.DNA聚合酶結(jié)合普通引物與高保真聚合酶結(jié)合硫化引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變基因片段全血基因組提取、引物退火溫度測(cè)試[模板為正?；蚪M DNA與CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因組DNA]、擴(kuò)增片段切膠回收后測(cè)

7、序。
　　2.高保真DNA聚合酶結(jié)合硫化引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”結(jié)合等位特異性實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變基因片段
　　將CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因組DNA稀釋成各濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),正?；蚪MDNA稀釋成各濃度梯度作為對(duì)照。
　　3.利用甲基化敏感限制性酶切法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)高甲基化RASSF1A片段以驗(yàn)證孕婦血漿DNA是否存在胎兒游離DNA。

8、　　采孕婦新鮮外周血5ml,制備血漿后提取孕婦血漿 DNA,限制性內(nèi)切酶 Hinp1I和Hha I進(jìn)行酶切后,實(shí)時(shí)定量PCR以RASSF1A為靶點(diǎn)檢測(cè)胎兒游離DNA。
　　4.普通PCR、LDR、毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合的改良方法檢測(cè)低豐度單核苷酸突變基因
　　4.1提取人類基因組全血DNA后送公司測(cè)序證實(shí)突變基因類型。將20pgCD17(A→T)突變雜合子、IVS-Ⅱ-654(C→T)雜合子突變型基因組DNA分別和1ng、10

9、ng、50ng、100ng的正常基因組DNA混合后建立β-地貧胎兒孕婦血漿模型,正?；蚪MDNA作為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 LDR反應(yīng)后結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物。計(jì)算靈敏度。
　　4.2檢測(cè)正常孕婦血漿中的微量單核苷酸突變
　　正常孕婦血漿DNA中加入20pg單核苷酸突變雜合子外周血DNA后進(jìn)行擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及LDR檢測(cè)反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1.無3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶結(jié)合普通引物進(jìn)行P

10、CR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)產(chǎn)物后可見未明顯體現(xiàn)等位特異性PCR擴(kuò)增的溫度特異性;有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶結(jié)合硫化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)產(chǎn)物后可見PCR擴(kuò)增退火溫度越高,特異性越好,至67.8℃時(shí),可判讀正?；蚺cCD41-42(del-CTTT)雜合突變基因。
　　2.將有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶與硫化引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè),在β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因

11、組DNA各濃度梯度中(分別為300ng、30ng、3ng、300pg、30pg)均可見明顯擴(kuò)增產(chǎn)物曲線;正常基因組DNA300ng擴(kuò)增產(chǎn)物可被檢出,其余各濃度梯度均未檢測(cè)出明顯擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　3.常規(guī)PCR、LDR反應(yīng)、毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)基因點(diǎn)突變的靈敏度
　　用自動(dòng)測(cè)序分析儀檢測(cè),該技術(shù)可檢測(cè)出以50ng正?；蚪MDNA中含有的20pgβ-地中海貧血雜合突變基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的LDR產(chǎn)物,且產(chǎn)物峰面積

12、與正常模板濃度成反比,檢測(cè)靈敏度最高為1:5000,陰性對(duì)照經(jīng)片段分析后未見LDR產(chǎn)物。
　　4.將酶切前后的孕婦血漿進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),可見RASSF1A基因酶切前后可均被檢出,且酶切后Ct值較酶切前延后2.28;β-actin基因作為對(duì)照酶切前可被檢出,酶切后未被檢出。
　　5.正常孕婦血漿基因組 DNA中加入單核苷酸突變雜合子外周血 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的LDR檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果,可見明顯連接產(chǎn)物峰。
　　結(jié)論: