白念珠菌酵母相和菌絲相細胞表達基因譜的構(gòu)建及聚類分析.pdf

1、近年來念珠菌感染已成為住院患者血行感染中第三或第四位最常見的病原菌，其中白念珠菌最為常見，占念珠菌屬40-70％。白念珠菌屬人體常居真菌，為條件致病真菌，一般以酶母相存在于機體，當機體免疫功能受到抑制或微生態(tài)失衡時，白念珠菌會轉(zhuǎn)變其生長形態(tài)，可由酵母相轉(zhuǎn)為菌絲相，進而對機體產(chǎn)生危害。體外培養(yǎng)條件下，白念珠菌也可以酶母相形式或菌絲相形式生長，這種酵母與菌絲之間的轉(zhuǎn)換稱為菌相轉(zhuǎn)換。 正因為白念珠菌在醫(yī)學中的重要地位，因此對其致病的機

2、制進行了廣泛深入的研究。近年來對白念珠菌的毒力因子研究主要集中于三個方面：①粘附；②酶類；③菌相轉(zhuǎn)換。 菌相轉(zhuǎn)換，即酵母相生長轉(zhuǎn)到菌絲相生長的這一變化是白念珠菌感染轉(zhuǎn)變的過程，菌絲多則感染率高；另一方面，當天然突變或人工中斷某些基因?qū)е虏荒苄纬删z的白念珠菌突變菌株，則在動物實驗中表現(xiàn)出毒力的降低或喪失，因此白念珠菌菌絲的形成與發(fā)病有一定的關(guān)系。已有的研究證實，菌絲的形成改變白念珠菌各種毒力因子的表達，致菌株毒力增加，感染性增強

3、。 為更全面的尋找白念珠菌酵母相和菌絲相致病相關(guān)基因及其毒力因子，本研究應(yīng)用LongSAGE技術(shù)，定性定量檢測白念珠菌酵母相和菌絲相細胞表達基因的改變，構(gòu)建白念珠菌酵母相和菌絲相細胞表達基因譜，聚類分析表達基因功能，探討酵母相和菌絲相細胞表達基因與菌相轉(zhuǎn)換、菌株毒力的相關(guān)性。 本研究選擇白念珠菌ATCC-90028作為研究菌株，經(jīng)RPMI1640體外誘導形成純的酵母相和菌絲相細胞作為研究材料，經(jīng)顯微鏡下計數(shù)其純度，細胞純

4、度超過95％用于提取RNA；提取純化細胞的RNA經(jīng)RT-PCR檢測，證實實驗菌株為白念珠菌，且酵母相細胞無菌絲相細胞污染后，使用分離的RNA進行LongSAGE標簽庫的構(gòu)建，這種使用細胞表型分子與特異性表達基因的雙重篩選，確保RNA來源于均一性細胞，使經(jīng)LongSAGE標簽庫分析獲得的基因表達譜，能夠代表該細胞的基因表達特征。 應(yīng)用相當于5X107細胞的總RNA用于構(gòu)建LongSAGE標簽庫。使用生物素化標記的Oligo-dT磁

5、珠結(jié)合mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)大腸桿菌DNA聚合酶、DNA連接酶合成cDNA第2鏈，合成的雙鏈cDNA使用延長因子與葡萄糖醛酸脫氫酶引物，PCR擴增檢測cDNA合成的有效性。錨定酶NlaⅢ酶切雙鏈cDNA后，將標本等分成兩份，分別使用適配子A和B與cDNA酶切后產(chǎn)物連接。連接后產(chǎn)物使用標簽酶MmeⅠ酶切，釋放單標簽，再將這兩種單標簽進行連接，得到含表達基因片段及適配子A和B的130bp雙標簽。規(guī)?；疨CR擴增130bp雙標簽后，

6、在聚丙烯酰胺凝膠上進行純化。純化后的130bp雙標簽用NlaⅢ酶切，得到34bp雙標簽。34bp雙標簽相互連接后形成串聯(lián)體。將串聯(lián)體連接導入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，驗證轉(zhuǎn)化效率后，轉(zhuǎn)化克隆進行DNA測序分析。最后提取標簽，建立表達標簽數(shù)據(jù)庫。本研究使用該技術(shù)共構(gòu)建2個LongSAGE標簽庫，分別為白念珠菌酵母相和菌絲相細胞。 本研究經(jīng)過相應(yīng)改進后，保證了LongSAGE標簽庫的成功構(gòu)建。主要改進有：(1)增加磁珠在磁場中的放置時間，

7、減少了磁珠的損失；(2)減少適配子的用量，提高了130bp雙標簽的產(chǎn)量與特異性；(3)二次洗脫聚丙烯酰胺凝膠，使DNA的回收量增加；(4)酚氯抽提凝膠上回收的DNA，防止核酶降解，串聯(lián)體產(chǎn)量增加。 研究中獲得白念珠菌酵母相細胞LongSAGE標簽17,769個，特異性標簽分為7,715種，菌絲相細胞LongSAGE標簽17,552個，特異性標簽6,940種。從白念珠菌酵母相和菌絲相細胞LongSAGE標簽分布狀態(tài)來看，處于不同生

8、長狀態(tài)下的白念珠菌表達的基因量類似，新標簽出現(xiàn)率較均一。白念珠菌菌相的轉(zhuǎn)換伴隨著菌絲相細胞獨特基因和部分基因的高表達，并由此導致白念珠菌以菌絲相生長。白念珠菌菌絲相細胞高表達基因可分為四類：(1)細胞表面分子類，如CYR1、HK1、CMD1等，這些分子參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，推測其在菌相轉(zhuǎn)換中起介導細胞基因表達的調(diào)控或細胞行為的改變；(2)代謝酶類，如AY445049、TPS2等，AY445049(beta-glucosidase，B葡糖

9、苷酶)表達量的上調(diào)可增強對雙糖、多糖的水解，有利于葡萄糖和其它單糖的吸改；(3)結(jié)構(gòu)基因類，如18S、25sRNA基因、HWP1、CDC11等，某些結(jié)構(gòu)基因在白念珠菌菌絲相狀態(tài)下獨特表達，可能是菌相轉(zhuǎn)換的結(jié)果；(4)功能不明的細胞分子，如HIS4、SLA2、soml、AJ390523等。 白念珠菌酵母相和菌絲相細胞表達基因譜的建立有助于闡明白念珠菌菌相轉(zhuǎn)換的機制，標簽庫中功能不明的細胞分子或有差異表達的高表達無匹配標簽值得深入研