伊文氏藍(lán)血管顯影方法及其在脊髓損傷中的應(yīng)用.pdf

1、脊髓損傷往往會(huì)導(dǎo)致患者的終生殘疾，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)痛苦和負(fù)擔(dān)，目前臨床上仍沒(méi)有良好的治療方法，所以對(duì)脊髓損傷的病理機(jī)制和治療方法是研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。脊髓損傷的病理過(guò)程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷對(duì)細(xì)胞和組織造成機(jī)械性損傷，并向周圍組織滲出各種有害因子，具有細(xì)胞毒性作用，引發(fā)繼發(fā)性損傷，并沿著脊髓縱軸向頭尾兩端擴(kuò)展，形成數(shù)倍于原發(fā)性損傷的壞死區(qū)。所以繼發(fā)性損傷的形成機(jī)制、病理變化以及減輕繼發(fā)性損傷的方法成為極其重要的研究課

2、題。脊髓損傷過(guò)程中，缺血是重要的病理機(jī)制，因?yàn)檠髁康慕档蜁?huì)加重脊髓的損傷。為了研究脊髓繼發(fā)性損傷中的缺血問(wèn)題，有效顯示血管并結(jié)合免疫組織化學(xué)研究的血管顯影方法是必要的研究手段。 目前常用的血管顯影方法有墨汁灌注法，免疫組織化學(xué)方法，單寧酸媒染法，酶組織化學(xué)法等等，但這些方法各有弊端，如不能與免疫組織化學(xué)研究相結(jié)合，過(guò)程繁瑣或熒光易淬滅等。本實(shí)驗(yàn)采用伊文氏藍(lán)進(jìn)行血管顯影，伊文氏藍(lán)是一種熒光染料，在白光下呈藍(lán)色，在熒光顯微鏡綠色激

3、發(fā)光下呈鮮紅色，用于研究血腦屏障通透性的改變。它可與血漿白蛋白結(jié)合形成伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合體，再與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的血漿白蛋白受體結(jié)合，因此理論上應(yīng)該可以通過(guò)灌注方法顯示血管形態(tài)。 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分為伊文氏藍(lán)血管顯影方法的建立。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6小鼠和SD（Sprague-Dawley）大鼠。其中C57BL/6小鼠12只，分為空白對(duì)照組，正常灌注固定組。正常灌注固定組小鼠經(jīng)股靜脈注射伊文氏藍(lán)后（空白對(duì)照組注射生理

4、鹽水），灌注生理鹽水和多聚甲醛，冰凍切片三套，一套直接100％酒精脫水透明，中性樹(shù)膠封片，一套HE染色，一套免疫組化檢測(cè)GFAP。SD大鼠15只，分為正常組伊文氏藍(lán)灌注后固定組和正常組伊文氏藍(lán)灌注前固定組。其中灌注后固定組又分為空白對(duì)照組，正常灌注固定組，顯影過(guò)程類似于小鼠。灌注前固定組又分為5％明膠伊文氏藍(lán)組，明膠-鉻明礬-伊文氏藍(lán)-白蛋白組（簡(jiǎn)稱明-鉻-藍(lán)組），對(duì)正常大鼠灌注生理鹽水和多聚甲醛后，分別注射配制的兩種造影溶液，待明膠凝

5、固后進(jìn)行取材，冰凍切片后直接100％酒精脫水透明，中性樹(shù)膠封片，或進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。結(jié)果表明，正常C57BL/6小鼠注射5％伊文氏藍(lán)0.5ml時(shí)，能夠清晰地觀察到脊髓內(nèi)的血管。SD大鼠正常組伊文氏藍(lán)灌注后固定組中注射8％伊文氏藍(lán)5ml時(shí)，能夠清晰地觀察到脊髓內(nèi)血管的形態(tài)分布；正常組伊文氏藍(lán)灌注前固定組中，SD大鼠灌注后注射5％明膠伊文氏藍(lán)溶液時(shí)血管填充充分，輪廓清晰，而明-鉻-藍(lán)組可以顯示血管的同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)復(fù)染。 第

6、二部分將建立的血管顯影方法用于脊髓損傷的研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，損傷2周后分別采用大鼠灌注后固定組和灌注前固定組方法進(jìn)行血管顯影，冰凍切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。結(jié)果顯示，灌注后固定組可觀察損傷區(qū)與正常組織交界部位的血管結(jié)構(gòu)以及血-脊髓屏障破壞情況，相鄰切片可進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。灌注前固定組中顯影液為5％明膠伊文氏藍(lán)時(shí)，血管形態(tài)清晰，鄰近損傷區(qū)伊文氏藍(lán)彌散很少，而顯影液為GCEA灌注液時(shí)，能夠顯示血管并進(jìn)行免疫組織化學(xué)復(fù)染，但血管形